Molecular modulation of brain development and function: lessons from “old” and “new”

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

Ankylosing spondylitis: genomic and functional characterization of candidate genes and their repercussion in clinical practice

RESUMO: Introdução: A espondilite anquilosante (EA) é uma doença inflamatória crónica caracterizada pela inflamação das articulações sacroilíacas e da coluna. A anquilose progressiva motiva uma deterioração gradual da função física e da qualidade de vida. O diagnóstico e o tratamento precoces podem contribuir para um melhor prognóstico. Neste contexto, a identificação de biomarcadores, assume-se como sendo muito útil para a prática clínica e representa hoje um grande desafio para a comunidade científica. Objetivos: Este estudo teve como objetivos: 1 - caracterizar a EA em Portugal; 2 - investigar possíveis associações entre genes, MHC e não-MHC, com a suscetibilidade e as características fenotípicas da EA; 3 - identificar genes candidatos associados a EA através da tecnologia de microarray. Material e Métodos: Foram recrutados doentes com EA, de acordo com os critérios modificados de Nova Iorque, nas consultas de Reumatologia dos diferentes hospitais participantes. Colecionaram-se dados demográficos, clínicos e radiológicos e colhidas amostras de sangue periférico. Selecionaram-se de forma aleatória, doentes HLA-B27 positivos, os quais foram tipados em termos de HLA classe I e II por PCR-rSSOP. Os haplótipos HLA estendidos foram estimados pelo algoritmo Expectation Maximization com recurso ao software Arlequin v3.11. As variantes alélicas dos genes IL23R, ERAP1 e ANKH foram estudadas através de ensaios de discriminação alélica TaqMan. A análise de associação foi realizada utilizando testes da Cochrane-Armitage e de regressão linear, tal como implementado pelo PLINK, para variáveis qualitativas e quantitativas, respetivamente. O estudo de expressão génica foi realizado por Illumina HT-12 Whole-Genome Expression BeadChips. Os genes candidatos foram validados usando qPCR-based TaqMan Low Density Arrays (TLDAs). Resultados: Foram incluídos 369 doentes (62,3% do sexo masculino, com idade média de 45,4 ± 13,2 anos, duração média da doença de 11,4 ± 10,5 anos). No momento da avaliação, 49,9% tinham doença axial, 2,4% periférica, 40,9% mista e 7,1% entesopática. A uveíte anterior aguda (33,6%) foi a manifestação extra-articular mais comum. Foram positivos para o HLA-B27, 80,3% dos doentes. Os haplótipo A*02/B*27/Cw*02/DRB1*01/DQB1*05 parece conferir suscetibilidade para a EA, e o A*02/B*27/Cw*01/DRB1*08/DQB1*04 parece conferir proteção em termos de atividade, repercussão funcional e radiológica da doença. Três variantes (2 para IL23R e 1 para ERAP1) mostraram significativa associação com a doença, confirmando a associação destes genes com a EA na população Portuguesa. O mesmo não se verificou com as variantes estudadas do ANKH. Não se verificou associação entre as variantes génicas não-MHC e as manifestações clínicas da EA. Foi identificado um perfil de expressão génica para a EA, tendo sido validados catorze genes - alguns têm um papel bem documentado em termos de inflamação, outros no metabolismo da cartilagem e do osso. Conclusões: Foi estabelecido um perfil demográfico e clínico dos doentes com EA em Portugal. A identificação de variantes génicas e de um perfil de expressão contribuem para uma melhor compreensão da sua fisiopatologia e podem ser úteis para estabelecer modelos com relevância em termos de diagnóstico, prognóstico e orientação terapêutica dos doentes. -----------ABSTRACT: Background: Ankylosing Spondylitis (AS) is a chronic inflammatory disorder characterized by inflammation in the spine and sacroiliac joints leading to progressive joint ankylosis and in progressive deterioration of physical function and quality of life. An early diagnosis and early therapy may contribute to a better prognosis. The identification of biomarkers would be helpful and represents a great challenge for the scientific community. Objectives: The present study had the following aims: 1- to characterize the pattern of AS in Portuguese patients; 2- to investigate MHC and non-MHC gene associations with susceptibility and phenotypic features of AS and; 3- to identify candidate genes associated with AS by means of whole-genome microarray. Material and Methods: AS was defined in accordance to the modified New York criteria and AS cases were recruited from hospital outcares patient clinics. Demographic and clinical data were recorded and blood samples collected. A random group of HLA-B27 positive patients and controls were selected and typed for HLA class I and II by PCR-rSSOP. The extended HLA haplotypes were estimated by Expectation Maximization Algorithm using Arlequin v3.11 software. Genotyping of IL23R, ERAP1 and ANKH allelic variants was carried out with TaqMan allelic discrimination assays. Association analysis was performed using the Cochrane-Armitage and linear regression tests as implemented in PLINK, for dichotomous and quantitative variables, respectively. Gene expression profile was carried out using Illumina HT-12 Whole-Genome Expression BeadChips and candidate genes were validated using qPCR-based TaqMan Low Density Arrays (TLDAs). Results: A total of 369 patients (62.3% male; mean age 45.4±13.2 years; mean disease duration 11.4±10.5 years), were included. Regarding clinical disease pattern, at the time of assessment, 49.9% had axial disease, 2.4% peripheral disease, 40.9% mixed disease and 7.1% isolated enthesopathic disease. Acute anterior uveitis (33.6%) was the most common extra-articular manifestation. 80.3% of AS patients were HLA-B27 positive. The haplotype A*02/B*27/Cw*02/DRB1*01/DQB1*05 seems to confer susceptibility to AS, whereas A*02/B*27/Cw*01/DRB1*08/DQB1*04 seems to provide protection in terms of disease activity, functional and radiological repercussion. Three markers (two for IL23R and one for ERAP1) showed significant single-locus disease associations. Association of these genes with AS in the Portuguese population was confirmed, whereas ANKH markers studied did not show an association with AS. No association was seen between non-MHC genes and clinical manifestations of AS. A gene expression signature for AS was established; among the fourteen validated genes, a number of them have a well-documented inflammatory role or in modulation of cartilage and bone metabolism. Conclusions: A demographic and clinical profile of patients with AS in Portugal was established. Identification of genetic variants of target genes as well as gene expression signatures could provide a better understanding of AS pathophysiology and could be useful to establish models with relevance in terms of susceptibility, prognosis, and potential therapeutic guidance.

Bioactive beads for local sensing of proteases in 3D engineered tissues

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Bioengenharia (MIT)

Safety function analysis in an industrial production process

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia e Gestão Industrial

Heat recovery from wastewater: numerical modelling of sewer systems

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente, perfil Engenharia Sanitária

Structure-function relationships in a glycosyltransferase, a phosphatase and an oxidoreductase

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biochemistry

O2/CO2-sensitive cyclic AMP-signalling pathway in peripheral chemoreceptors

RESUMO: O corpo carotídeo (CB) é um pequeno órgão sensível a variações na PaO2, PaCO2 e pH. As células tipo I (células glómicas) do corpo carotídeo, as unidades sensoriais deste órgão, libertam neurotransmissores em resposta às variações dos gases arteriais. Estes neurotransmissores atuam quer em recetores pré-sinápticos, localizados nas células tipo I, quer em recetores póssinápticos, localizados nas terminações do nervo do seio carotídeo, ou em ambos. A activação dos recetores pré-sinápticos modula a atividade do corpo carotídeo, enquanto que, a activação dos recetores pós-sinápticos, de carater excitatório, desencadeia um aumento da frequência de descarga das fibras do CSN, com subsequente despolarização dos neurónios do gânglio petroso, e posterior despolarização de um grupo específico de neurónios do centro respiratório central, desencadeando, como resposta final, hiperventilação. Estes recetores pré- e pós-sinápticos podem ser classificados em ionotrópicos ou metabotrópicos, estando os últimos acoplados a adenilatos ciclases transmembranares (tmAC). O mecanismo exato pelo qual as variações dos gases arteriais são detetadas pelo CB não se encontra ainda completamente elucidado, mas tem sido sugerido que alterações nos níveis de cAMP estejam associadas ao mecanismo de deteção de variações de O2 e CO2. Os níveis de cAMP podem ser regulados através da sua via de síntese, mediada por dois tipos de adenilatos ciclases: tmAC sensível aos eurotransmissores e adenilato ciclase solúvel (sAC)sensível a variações de HCO3/CO2, e pela sua via de degradação mediada por fosfodiesterases. A via de degradação do cAMP pode ser manipulada farmacologicamente, funcionando enquanto alvo terapêutico para o tratamento de patologias do foro respiratório (e.g. asma, hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstructiva crónica e apneia do sono), que induzem um aumento da actividade do CB.O trabalho descrito nesta dissertação partiu da hipótese de que a actividade do CB é manipulada por fármacos, que interferem com a via de sinalização do cAMP, tendo sido nosso objectivo geral, investigar o papel do cAMP na quimiotransdução do CB de rato, e determinar se a actividade dos enzimas responsáveis pela via de sinalização do cAMP é ou não regulada por variações de O2/CO2. Assim, a relevância deste trabalho é a de estudar e identificar possíveis alvos moleculares (sAC, isoformas de tmAC e PDE) com potencial para serem usados no tratamento de patologias relacionadas com o controlo respiratório. A primeira parte do presente trabalho, centrou-se na caracterização farmacológica da PDE4 no CB e em tecidos não quimiorecetores (e.g. gânglio cervical superior e artérias carótidas), e na observação do efeito de hipóxia aguda na acumulação dos níveis de cAMP, induzidos pelos inibidores de PDE, nestes tecidos. A quantificação de cAMP foi efectuada por técnica imunoenzimática (EIA), tendo sido elaboradas curvas de dose-resposta para os efeitos de inibidores, não específicos (IBMX) e específicos para a PDE2 e PDE4 (EHNA, Rolipram e Ro 20-1724), nos níveis de cAMP acumulados, em situações de normóxia (20%O2/5%CO2) e hipóxia (5%O2/5%CO2). A caracterização das PDE no gânglio cervical superior foi aprofundada, utilizando-se a técnica de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) em culturas primárias de neurónios, na presença de inibidores não específicos (IBMX) e específicos para a PDE3 e PDE4 (milrinone e rolipram, respetivamente). Foram igualmente estudadas, através de RT-qPCR, as alterações na expressão de PDE3A-B e PDE4A-D, no gânglio cervical superior, em resposta a diferentes percentagens de oxigénio. Na segunda parte do trabalho investigou-se a via de síntese do cAMP no CB em resposta a variações na concentração de HCO3/CO2. Em concreto, o protocolo experimental centrou-se na caracterização da sAC, dado que a sua actividade é regulada por variações de HCO3/CO2. A caracterização da expressão e regulação da sAC, em resposta a variações de HCO3/CO2 ,foi efectuada no CB e em tecidos não quimioreceptores periféricos (e.g. gânglio cervical superior, petroso e nodoso) por qRT-PCR. A actividade deste enzima foi caracterizada indirectamente através da quantificação dos níveis de cAMP (quantificação por EIA), induzidos por diferentes concentrações de HCO3/CO2, na presença de MDL-12,33-A, um inibidore da tmAC. A expressão das isoformas da tmAC no CB e gânglio petroso foi determinada por RT-qPCR. Adicionalmente, estudámos a contribuição relativa da tmAC e sAC no mecanismo de sensibilidade ao CO2 no CB. Para o efeito foram estudadas as alterações: 1) nos níveis de cAMP (quantificado por EIA) na presença de diferentes concentrações de HCO3/CO2 e ao longo do tempo (5-30 min); 2) na ativação da proteína cinase A (PKA, FRET baseado em sensores) em células tipo I do CB; e 3) na frequência de descarga do CSN (registos) na presença e ausência de ativadores e inibidores da sAC,tmAC e PKA. Por último, foi caracterizada a expressão e actividade da sAC nos quimioreceptors centrais (locus ceruleus, rafe e medula ventro-lateral) através de técnicas de RT-qPCR e EIA. A expressão das isoformas da tmAC foi aprofundada no locus coeruleus através de RT-qPCR. Por fim, comparámos a contribuição da tmAC e sAC nos níveis de cAMP no locus coeruleus em condições de normocapnia e hipercapnia.O nosso trabalho teve os seguintes resultados principais: 1) PDE4 está funcional no corpo carotídeo, artérias carótidas e gânglio cervical superior de rato, embora a PDE2 só se encontre funcional neste último; 2) Os efeitos dos inibidores de PDE nos níveis de acumulação de cAMP foram exacerbados em situações de hipóxia aguda no CB e artérias carótidas, mas foram atenuados no gânglio cervical superior; 3) No gânglio cervical superior, diferentes tipos de células apresentaram uma caracterização específica de PDEs, sugerindo uma subpopulação de células neste gânglio com funções fisiológicas distintas; 4) Embora todas as isoformas de PDE4 e PDE3 estivessem presentes no gânglio, a PDE3a, PDE4b e a PDE4d foram as isoformas mais expressas. Por outro lado, incubações de gânglio cervical superior, em diferentes percentagens de oxigénio, não alteraram (não regularam) significativamente a expressão das diferentes isoformas de PDE neste órgão; 5) a sAC encontra-se expressa e funcional no CB e nos quimiorecetores centrais estudados (locus coeruleus, rafe e medula ventrolateral). A sAC apresenta maior expressão no CB comparativamente aos restantes orgãos estudados, exceptuando os testículos, orgão controlo. Variações de HCO3/CO2 de 0/0 para 24/5 aumentaram os níveis de cAMP no CB e quimiorecetores centrais, tendo sido o aumento mais significativo observado no CB. Concentrações acima dos 24mM HCO3/5%CO2 não induziram alterações nos níveis de cAMP, sugerindo que a actividade da sAC se encontra saturada em condições fisiológicas (normocapnia) e que este enzima não desempenha qualquer papel na deteção de situações de hipercapnia; 6) No CB, a expressão das isoformas tmAC1, tmAC4, tmAC6 e tmAC9 é mais elevada comparativamente à expressão da sAC; 7) Utilizamos diferentes inibidores da tmAC (MDL 12-330A, 500μM, 2’5’-ddADO, 30-300μM, SQ 22536, 200μM) e da sAC (KH7, 10-100μM) para estudar a contribuição relativa destes enzimas na acumulação do cAMP no CB. Tanto a tmAC como a sAC contribuem para a acumulação dos níveis de cAMP em condições de hipercapnia. Contudo, existe um maior efeito destes inibidores nas condições de 12 mM HCO3/2.5%CO2 do que em condições de normocapnia e hipercapnia, sugerindo um papel relevante destes enzimas na atividade do CB em situações de hipocapnia; 8) Não se observaram variações nos níveis de cAMP em resposta a diferentes concentrações de HCO3/CO2 ao longo do tempo (5-30 min). O efeito inibitório induzido por ddADO e KH7 foi sobreponível após 5 ou 30 minutos de incubação em todas as concentrações de HCO3/CO2 estudadas; 9) Por último, verificou-se um aumento na frequência da descarga do nervo do seio carotídeo entre as condições de normocapnia e hipercapnia acídica. Ao contrário do KH7 (10μM), o 2’5’-ddADO reduziu significativamente a frequência de descarga do nervo, quer em condições de normocapnia quer de hipercapnia acídica. Contudo, não se verificou aumento na frequência de descarga do nervo entre normocapnia e hipercapnia isohídrica, sugerindo que a sensibilidade à hipercapnia no CB é mediada por variações de pH. Em conclusão, os resultados decorrentes deste trabalho permitiram demonstrar que, embora os enzimas que medeiam a via de sinalização do cAMP possam ser bons alvos terapêuticos em condições particulares, a sua actividade não é específica para o CB. Os resultados sugerem ainda que o cAMP não é um mediador específico da transdução à hipercapnia neste orgão. Contudo, os nossos resultados demonstraram que os níveis de cAMP são mais elevados em condições fisiológicas, o que sugere que o cAMP possa ter uma função homeostática neste orgão. Por último, o presente trabalho demonstrou que os aumentos de cAMP descritos por outros em condições de hipercapnia, não são observáveis quando o pH se encontra controlado. ------------------ ABSTRACT: The work presented in this dissertation was aimed to establish how specific is cAMP-signaling pathways in the CB mainly in different CO2 conditions and how O2 concentrations alter/drives the manipulation of cAMP signaling in the CB. The experimental studies included in this thesis sought to investigate the role of cAMP in the rat CB chemotransduction mechanisms and to determine whether the enzymes that participate in cAMP signal transduction in the CB are regulated by O2/CO2. We characterized the enzymes involved in the cAMP-signaling pathway in the CB (sAC, tmAC, PDE) under different O2/CO2 conditions. Our results demonstrated that many of these enzymes are involved in CO2/O2 sensing and while they may be useful in treating conditions with alterations in CO2/O2 sensing,they will not be specific to chemoreception within the CB: 1) PDE4 is ubiquitously expressed in CB and non-chemoreceptor related tissues and their affinity to inhibitors change with O2 tensions in both CB and carotid arteries, and 2) sAC and tmAC are expressed in peripheral and central chemo- and non-chemoreceptor tissues and their effect on cAMP levels do not change between normocapnic and isohydric hypercapnic conditions. Our results provide evidence against a specific role of cAMP as a mediator for O2 and CO2 chemotransduction in the rat CB and emphasized the role of pH in CO2 sensitivity of the CB. Furthermore, our results demonstrate that cAMP levels are maintained higher under physiological conditions, supporting recent finding from our lab, which all together suggests that cAMP has a homeostatic function in this organ.

The compliance function in banking: Perspective and future in the age of globalization

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Management from the NOVA – School of Business and Economics

Establishment and characterization of a human model of the blood-brain barrier

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade N ova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Micropollutant bioremoval in wastewater treatment systems: from microbial population structure to function

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

Hedging in a discontinuous market: the barrier option

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Finance from the NOVA – School of Business and Economics

Uncovering the role of IFNAR1 in Experimental Cerebral malaria

Dissertation presented the Ph.D degree in Biology

STRUCTURE-FUNCTION ANALYSIS OF MULTI-COPPER OXIDASES

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biochemistry, Structural Biochemistry

Dissecting the function of the SpoIIIJ and YqjG membrane protein insertases during bacterial spore development

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology, Microbial Biology

Regulation and function of the cell wall polymer lipoteichoic acid in staphylococcus aureus

A thesis submitted for the Degree of Master in Medical microbiology