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Resumo:
O vrus da hepatite delta (HDV) o agente etiolgico de uma das formas mais graves de hepatite viral e ainda endmico em diversas regies do globo, nomeadamente em frica, na Amaznia e no Extremo Oriente. O HDV co-infecta ou super-infecta hepatcitos infectados com o vrus da hepatite B (HBV) aumentando em cerca de 10 vezes o risco de cirrose e hepatite fulminante. A associao clnica entre os dois vrus deve-se ao facto do invlucro do HDV ser constitudo pelos antignios de superfcie do HBV (HBsAgs) que so necessrios para a propagao da infeco. O genoma do HDV constitudo por uma molcula de RNA de cadeia simples, circular, com cerca de 1.7 Kb, que possui cerca de 70% de emparelhamento interno. Foi identificada uma nica grelha de leitura aberta (ORF) no RNA viral que codifica para o antignio delta (HDAg). A ocorrncia de um mecanismo de editing do RNA, resulta na expresso de duas formas do HDAg, a pequena (S-HDAg) e a grande (L-HDAg). Vrias funes essenciais para a replicao do HDV tm sido atribudas a ambas as formas do HDAg, sendo a S-HDAg essencial para a acumulao de RNA viral e a L-HDAg responsvel pela interaco com os HBsAgs para formar partculas virais. No entanto, dada a simplicidade dos seus componentes, admite-se que a replicao viral depende das interaces estabelecidas entre os HDAgs e factores celulares do hospedeiro. Apesar do nmero considervel de factores celulares descritos como interactores dos HDAgs ou RNA virais, a importncia de muitas destas interaces no foi elucidada e muitas etapas do ciclo de replicao do HDV permanecem pouco claras. Para alm disso, dado o nmero limitado de factores do hospedeiro que esto envolvidos na sua replicao, muito provvel que um nmero elevado de interactores do HDV permanea por identificar. Este trabalho teve como objectivo a identificao de protenas de fgado humano capazes de interagir com os HDAgs, utilizando o sistema yeast Two-Hybrid (YTH). Identificaram-se trinta protenas com capacidade de interagir com a S-HDAg no sistema YTH, sendo que estas protenas se encontram envolvidas em diferentes processos celulares. Com base nas caractersticas funcionais, foram seleccionadas trs destas protenas e as suas interaces com a S-HDAg foram investigadas com maior detalhe. As trs protenas seleccionadas foram a ribonucleoprotena nuclear heterognea C (hnRNPC), a embryonic lethal abnormal vision like1 (ELAVL1/HuR) e a protena 2 de ligao a EBNA1 (EBP2). As duas primeiras so protenas de ligao a RNA, previamente descritas como envolvidas em processos de replicaes de outros vrus com genoma RNA, enquanto a EBP2, uma protena de localizao preferencialmente nucleolar, tal como por vezes acontece com os HDAgs. As interaces foram analisadas recorrendo a vrios ensaios bioqumicos. No caso da hnRNPC e da HuR, aps validao no sistema YTH, a capacidade de interaco com a S-HDAg foi confirmada quer in vitro por blot overlay quer in vivo por co-imunoprecipitao em clulas de hepatoma humano. Nas mesmas clulas, observou-se uma co-localizao considervel entre os HDAgs e os RNAs virais. Finalmente, de modo a investigar a contribuio das protenas hnRNPC e HuR na replicao do HDV, procedeu-se ao silenciamento destas protenas pela utilizao de short hairpin RNAs (shRNAs) especficos para os mRNAs correspondentes Observou-se que o silenciamento de ambas as protenas hnRNPC e HuR endgenas, individualmente resultou numa diminuio acentuada nos nveis de expresso dos HDAgs. No que respeita EBP2, a interaco com a S-HDAg foi confirmada em condies in vitro com recurso a ensaios de blot overlay e de cromatografia de afinidade. A anlise por imunofluorescncia indirecta e microscopia confocal revelou co-localizao elevada entre os HDAgs e a EBP2, principalmente nos nuclolos de clulas de hepatoma humano. Finalmente, foi ainda utilizado o sistema YTH para estudar os mecanismos de importao dos HDAgs. Assim, este sistema foi utilizado com o propsito de identificar protenas celulares capazes de interagir com um domnio especfico dos HDAgs, o sinal de localizao nuclear (NLS). Na pesquisa YTH realizada obtiveram-se 161 clones positivos, sendo que um deles mostrou codificar para a carioferina 4 (KPNA4). A interaco da KPNA4 com a S-HDAg foi reproduzida em condies in vitro atravs de um ensaio de cromatografia de afinidade tendo sido utilizadas formas recombinantes das duas protenas. Este trabalho permitiu identificar vrias protenas celulares que interagem com a S-HDAg. Obtiveram-se evidncias sugestivas de que algumas das protenas identificadas podem desempenhar funes importantes no ciclo de replicao do HDV e que abrem novas perspectivas para o estudo do ciclo de replicao do vrus.
Resumo:
Dissertation presented to obtain a Master degree in Biotechnology
Resumo:
Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente Perfil de Gesto e Sistemas Ambientais
Resumo:
Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Engenharia Civil
