Transcriptional regulation of the mannosyltransferase-encoding gene pigm in inherited glycosylphosphatidylinositol (GPI) deficiency

RESUMO:O glicosilfosfatidilinositol (GPI) é um complexo glicolipídico utlizado por dezenas de proteínas, o qual medeia a sua ancoragem à superfície da célula. Proteínas de superfície celular ancoradas a GPI apresentam várias funções essenciais para a manutenção celular. A deficiência na síntese de GPI é o que caracteriza principalmente a deficiência hereditária em GPI, um grupo de doenças autossómicas raras que resultam de mutações nos genes PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO e PIGT, os quais sao indispensáveis para a biossíntese do GPI. Uma mutação pontual no motivo rico em GC -270 no promotor de PIGM impede a ligação do factor de transcrição (FT) Sp1 à sua sequência de reconhecimento, impondo a compactação da cromatina, associada à hipoacetilação de histonas, e consequentemente, impedindo a transcrição de PIGM. Desta forma, a adição da primeira manose ao GPI é comprometida, a síntese de GPI diminui assim como as proteínas ligadas a GPI à superficie das células. Pacientes com Deficiência Hereditária em GPI-associada a PIGM apresentam trombose e epilesia, e ausência de hemólise intravascular e anemia, sendo que estas duas últimas características definem a Hemoglobinúria Paroxística Nocturna (HPN), uma doença rara causada por mutações no gene PIGA. Embora a mutação que causa IGD seja constitutiva e esteja presente em todos os tecidos, o grau de deficiência em GPI varia entre células do mesmo tecido e entre células de tecidos diferentes. Por exemplo nos granulócitos e linfócitos B a deficiência em GPI é muito acentuada mas nos linfócitos T, fibroblastos, plaquetas e eritrócitos é aproximadamente normal, daí a ausência de hemólise intravascular. Os eventos transcricionais que estão na base da expressão diferencial da âncora GPI nas células hematopoiéticas são desconhecidos e constituem o objectivo geral desta tese. Em primeiro lugar, os resultados demonstraram que os níveis de PIGM mRNA variam entre células primárias hematopoiéticas normais. Adicionalmente, a configuração dos nucleossomas no promotor de PIGM é mais compacta em células B do que em células eritróides e tal está correlacionado com os níveis de expressão de PIGM, isto é, inferior nas células B. A presença de vários motivos de ligação para o FT específico da linhagem megacariocítica-eritróide GATA-1 no promotor de PIGM sugeriu que GATA-1 desempenha um papel regulador na sua transcrição. Os resultados mostraram que muito possivelmente GATA-1 desempenha um papel repressor em vez de activador da expressão de PIGM. Resultados preliminares sugerem que KLF1, um factor de transcrição restritamente eritróide, regula a transcrição de PIGM independentemente do motivo -270GC. Em segundo lugar, a investigação do papel dos FTs Sp demonstrou que Sp1 medeia directamente a transcrição de PIGM em ambas as células B e eritróide. Curiosamente, ao contrário do que acontece nas células B, em que a transcrição de PIGM requer a ligação do FT geral Sp1 ao motivo -270GC, nas células eritróides Sp1 regula a transcrição de PIGM ao ligar-se a montante e não ao motivo -270GC. Para além disso, demonstrou-se que Sp2 não é um regulador directo da transcrição de PIGM quer nas células B quer nas células eritróides. Estes resultados explicam a ausência de hemólise intravascular nos doentes com IGD associada a PIGM, uma das principais características que define a HPN. Por último, resultados preliminares mostraram que a repressão da transcrição de PIGM devida à mutação patogénica -270C>G está associada com a diminuição da frequência de interacções genómicas em cis entre PIGM e os seus genes “vizinhos”, sugerindo adicionalmente que a regulação de PIGM e desses genes é partilhada. No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese contribuem para o conhecimento do controlo transcricional de um gene housekeeping, específico-detecido, por meio de FTs genéricos e específicos de linhagem.-------------ABSTRACTC: Glycosylphosphatidylinositol (GPI) is a complex glycolipid used by dozens of proteins for cell surface anchoring. GPI-anchored proteins have various functions that are essential for the cellular maintenance. Defective GPI biosynthesis is the hallmark of inherited GPI deficiency (IGD), a group of rare autosomal diseases caused by mutations in PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO and PIGT, all genes indispensable for GPI biosynthesis. A point mutation in the -270GC-rich box in the core promoter of PIGM disrupts binding of the transcription factor (TF) Sp1 to it, imposing nucleosome compaction associated with histone hypoacetylation, thus abrogating transcription of PIGM. As a consequence of PIGM transcriptional repression, addition of the first mannose residue onto the GPI core and thus GPI production are impaired; and expression of GPI-anchored proteins on the surface of cells is severely impaired. Patients with PIGM-associated IGD suffer from life-threatening thrombosis and epilepsy but not intravascular haemolysis and anaemia, two defining features of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH), a rare disease caused by somatic mutations in PIGA. Although the disease-causing mutation in IGD is constitutional and present in all tissues, the degree of GPI deficiency is variable and differs between cells of the same and of different tissues. Accordingly, GPI deficiency is severe in granulocytes and B cells but mild in T cells, fibroblasts, platelets and erythrocytes, hence the lack of intravascular haemolysis.The transcriptional events underlying differential expression of GPI in the haematopoietic cells of PIG-M-associated IGD are not known and constitute the general aim of this thesis. Firstly, I found that PIGM mRNA levels are variable amongst normal primary haematopoietic cells. In addition, the nucleosome configuration in the promoter of PIGM is more compacted in B cells than in erythroid cells and this correlated with the levels of PIGM mRNA expression, i.e., lower in B cells. The presence of several binding sites for GATA-1, a mega-erythroid lineage-specific transcription factor (TF), at the PIGM promoter suggested that GATA-1 has a role on PIGM transcription. My results showed that GATA-1 in erythroid cells is most likely a repressor rather than an activator of PIGM expression. Preliminary data suggested that KLF1, an erythroid-specific TF, regulates PIGM transcription but independently of the -270GC motif. Secondly, investigation of the role of the Sp TFs showed that Sp1 directly mediates PIGM transcriptional regulation in both B and erythroid cells. However, unlike in B cells in which active PIGM transcription requires binding of the generic TF Sp1 to the -270GC-rich box, in erythroid cells, Sp1 regulates PIGM transcription by binding upstream of but not to the -270GC-rich motif. Additionally, I showed that Sp2 is not a direct regulator of PIGM transcription in B and erythroid cells. These findings explain lack of intravascular haemolysis in PIGM-associated IGD, a defining feature of PNH. Lastly, preliminary work shows that transcriptional repression of PIG-M by the pathogenic -270C>G mutation is associated with reduced frequency of in cis genomic interactions between PIGM and its neighbouring genes, suggesting a shared regulatory link between these genes and PIGM. Altogether, the results presented in this thesis provide novel insights into tissuespecific transcriptional control of a housekeeping gene by lineage-specific and generic TFs.

A utilização das aplicações interativas no ensino e aprendizagem das equações do 1.º grau

Numa época em que existe uma grande diversidade de ferramentas tecnológicas ao nosso dispor, é imprescindível que se reflita sobre o seu contributo para o ensino e aprendizagem. Este estudo pretende analisar de que forma é que a exploração das applets pode contribuir para o ensino e aprendizagem das equações do 1.º grau. Especificamente, pretende-se estudar como é que as mesmas podem contribuir para que os alunos efetuem a passagem da aritmética para a álgebra, desenvolvam o conceito de incógnita e de equação e compreendam os princípios de equivalência. Na revisão da literatura fez-se referência ao pensamento de Vygotsky, nomeadamente os aspetos importantes no âmbito da educação, tais como, a Zona de Desenvolvimento Proximal e a Atividade Mediada. Também foi focado o ensino e a aprendizagem da álgebra e referidas as tecnologias de informação e comunicação. Neste estudo a metodologia utilizada foi de natureza qualitativa tentando-se descrever, analisar e compreender os processos realizados por quatro alunos do 7.º ano. Foram analisadas várias tarefas que envolveram a aplicação das applets relacionadas com o ensino e aprendizagem das equações do 1.º grau. Ao longo da implementação do estudo os alunos mostraram-se motivados para a aprendizagem das referidas equações e divertidos quando recorriam à utilização das applets. Por vezes, as mesmas apresentaram limitações, o que implicou a adaptação das estratégias e contribuiu para a reflexão sobre a importância do professor. Os resultados obtidos parecem indicar que as applets podem funcionar como instrumento mediador uma vez que os alunos conseguiram apropriar-se dos conceitos matemáticos através das mesmas. Parecem também reforçar a importância que se deve dar, no ensino e aprendizagem das equações do 1º grau, a tarefas que permitem aos alunos efetuar a passagem da aritmética para a álgebra e a tarefas que apelem à necessidade do uso natural dos princípios de equivalência para que os alunos compreendam a sua aplicação.

Estudo numérico do fenómeno de vibração induzida por vórtices num cilindro com 1 grau de liberdade em OpenFoam

Esta dissertação tem o intuito de validar o código numérico OpenFoam para problemas de fenómeno de vibração induzida por desprendimento de vórtices num cilindro circular com um grau de liberdade transversal ao escoamento. Na primeira parte é simulado o escoamento em torno de um cilindro circular fixo, e na segunda parte o escoamento em torno do cilindro oscilatório. O número de Reynolds é 200 para todas as simulações e o movimento do cilindro é descrito segundo um sistema massa-mola e massa-mola-amortecedor. Para o movimento do cilindro utilizou-se o solver sixDoFRigidDisplacement e para a resolução de problemas de malha móvel o solver displacementLaplacian. O código numérico utilizado para o caso do cilindro fixo foi pimpleFoam e para o caso do cilindro oscilatório o pimpleDyMFoam. As simulações foram feitas através da resolução das equações de Navier-Stokes num domínio computacional bidimensional. Na simulação do escoamento em redor do cilindro fixo, os coeficientes de arrasto e sustentação e o número de Strouhal foram calculados e comparados com resultados da literatura. Os resultados estão próximos da realidade, no entanto observa-se que a dimensão da malha é muito importante para a precisão dos mesmos. Na simulação do escoamento em torno do cilindro oscilatório foram calculados os coeficientes de arrasto e sustentação e deslocamento do cilindro, para os sistemas massa-mola e massa-mola-amortecedor. Para os dois sistemas foi apresentada e comparada a evolução destes resultados em função da velocidade reduzida e por fim foram comparados. Observa-se que o fator de amortecimento afeta as respostas do cilindro, dependo da velocidade reduzida. Os resultados obtidos em ambos os estudos foram satisfatórios e conclui-se que o código OpenFoam é uma boa ferramenta para resolver problemas com o fenómeno de vibração induzida por vórtices.

Fabrico e compactação de misturas betuminosas temperadas

As misturas betuminosas temperadas caracterizam-se por serem produzidas a temperaturas mais baixas que as tradicionais a quente, existindo várias tecnologias disponíveis no mercado. A redução da temperatura (cerca de 25ºC) conduz a um menor consumo de combustível na central de produção e à diminuição das emissões poluentes. Na literatura é referida como vantagem adicional o aumento da distância de transporte da mistura. Tal é conseguido devido à menor temperatura de compactação deste tipo de mistura, esse tempo de transporte pode ainda aumentar caso se aumente a temperatura de fabrico da mistura. Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência das temperaturas de fabrico e de compactação no comportamento das misturas betuminosas temperadas. Neste estudo selecionou-se uma mistura betuminosa do tipo AC 20 base 35/50 (MB), utilizada em trabalhos laboratoriais anteriores. Esta mistura foi produzida com dois aditivos diferentes que permitem baixar a temperatura de fabrico e compactação, o Sasobit® e o Rediset®. As misturas foram fabricadas a 165ºC e 120 °C, compactadas a 150, 120 e 100 °C. Foram realizados os seguintes ensaios: ensaio de escorrimento para avaliar o comportamento da mistura durante a fase de produção; avaliação volumétrica para analisar a compactibilidade; e ensaio de deformação permanente para avaliar o desempenho em serviço Os resultados obtidos com este trabalho permitem concluir que o aumento da temperatura de fabrico não influencia o comportamento da mistura. Obtiveram-se resultados semelhantes para a mistura quando fabricada a temperaturas diferentes. A mistura apresenta resultados consistentes relativamente à volumetria e à deformação permanente.

Estudo sobre o Grau de Integração de Organizações de Saúde – EGIOS II

RESUMO - O movimento de integração dos cuidados de saúde tem como objectivo a procura de modelos de prestação de cuidados mais compreensivos, integrados e continuados. A determinação do grau de integração de cuidados pode ser realizada a partir da percepção dos profissionais de saúde, sendo os inquéritos por questionários uma fonte comummente utilizada neste tipo de estudos. O presente estudo, designado por EGIOS II, tem como objetivos: a) determinar o grau de percepção de integração, dos profissionais das Unidades Locais de Saúde; b) comparar a percepção do grau de integração dos profissionais entre 2010 e 2015; c) comparar a percepção do grau de integração dos profissionais que trabalham nas Unidades Locais de Saúde e em instituições não organizadas em Unidades Locais de Saúde; e d) identificar as áreas de maior e menor percepção de integração. O instrumento de recolha de dados utilizado, foi um inquérito por questionário, que pretende avaliar a percepção do grau de integração dos profissionais de acordo com as dimensões clínica, informação, normativa, administrativa, financeira e sistémica, em 53 itens. O inquérito foi estruturalmente adaptado do Health System Integration Study, tendo apresentado validade e fiabilidade. O inquérito foi aplicado em 22 instituições, a nível nacional, Unidades Locais de Saúde e a Centros Hospitalares / Hospitais e Agrupamentos de Centros de Saúde. A caraterização EGIOS II dividiu-se em quatro fases: preparação e envio dos ofícios; identificação dos interlocutores; envio dos inquéritos; e avaliação dos resultados. O inquérito apresentou uma taxa de resposta de 27%, representando 2085 respostas ao inquérito. Pode afirmar-se que globalmente o estudo apresenta representatividade estatística, com um intervalo de confiança de 95%. Os resultados indicam que os profissionais das Unidades Locais de Saúde em 2015 reportam maiores níveis de percepção de integração, quando comparados os dados com o estudo de 2010. Acrescenta-se que os profissionais das Unidades Locais de Saúde têm um maior grau de percepção de integração, do que os profissionais dos Centros Hospitalares / Hospitais e Agrupamentos de Centros de Saúde, não organizados em ULS. As dimensões administrativa, financeira e clínica são as que apresentam um menor grau de percepção de integração e as dimensões normativa e informação uma maior percepção de integração. Os órgãos de administração e órgãos de gestão intermédia apresentam uma percepção de integração superior comparativamente aos médicos e enfermeiros dos serviços hospitalares e cuidados de saúde primários. Foram identificadas nove recomendações que poderão servir como base para um plano de ação subsequente do presente estudo ou para aplicação em futuros estudos. Este estudo pode auxiliar no diagnóstico de problemas e barreiras da integração de cuidados, em que serviços atuar e ainda, identificar quais as estratégias e processos a priorizar de forma a melhorar a integração de cuidados de saúde.

Efeito das condições de fabrico e compactação no comportamento mecânico de misturas betuminosas temperadas

As Misturas Betuminosas Temperadas (MBT) são misturas produzidas a temperaturas mais baixas que as tradicionais a quente, resultando na diminuição da quantidade de energia necessária durante a produção e da emissão de gases poluentes, com melhoria das condições de trabalho dos operários. Estas misturas devem apresentar um comportamento semelhante às tradicionais de modo a se obterem pavimentos com igual durabilidade. Neste trabalho pretendeu-se investigar o efeito da variação das temperaturas de fabrico e de compactação no comportamento em serviço da mistura betuminosa. Para tal, realizou-se o estudo experimental de uma mistura betuminosa (AC 20 base), com incorporação de diferentes aditivos, produzida a temperaturas várias. O efeito dos diferentes aditivos no comportamento reológico do betume a temperaturas elevadas foi avaliado através da medição da viscosidade dinâmica. O desempenho da mistura foi avaliado através do ensaio de deformação permanente e do ensaio de sensibilidade à água. Os resultados do ensaio de sensibilidade à água mostram um efeito claro das temperaturas de produção na resistência da mistura, com os melhores resultados obtidos para as temperaturas sugeridas pelo produtor. Os resultados do ensaio de deformação permanente apresentam maior dependência do tipo de aditivo utilizado do que das temperaturas. Assim, conclui-se que a produção de misturas betuminosas temperadas com incorporação de aditivos não compromete o comportamento em serviço do pavimento desde que sejam utilizadas as temperaturas adequadas para esse tipo de mistura.