Análise do polimorfismo HLA/DR-DQ em Angolanos portadores de Diabetes Mellitus tipo I

A diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é o distúrbio endócrino-metabólico mais frequente em crianças. É uma doença autoimune resultado da destruição selectiva das células beta pancreáticas. A velocidade de destruição das células beta pode ser rápida em algumas pessoas e lenta em outras; esta última é típica de adulto é conhecido como diabetes autoimune latente em adulto (LADA). A sua etiologia envolve factores ambientais e genéticos, dos genes envolvidos a maior contribuição vem da região do genoma onde estão localizados os genes do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC). A combinação de diferentes alelos do sistema de antigénio leucocitário humano tipo II (HLAII) esta associada a susceptibilidade da doença e as principais molécula envolvidas são a DQ e DR. O estágio pré-clínico da doença se caracteriza pela presença de auto-anticorpos, sendo o anti-GAD o mais sensível nesta patologia. OBJECTIVO: Analizar a frequência dos polimorfismos HLA-DR/DQ em angolanos portadores de diabetes tipo 1, residentes em Luanda. O tipo de estudo adotado foi casocontrolo num universo de voluntários provenientes da consulta externa de hospitais e clínicas locais no período de outubro de 2012 a outubro 2013. A amostra biológica utilizada foi sangue total, tendo sido processada no laboratório LABGENE, da Faculdade de Medicina (FM) da Universidade Agostinho Neto (UNA). Os auto-anticorpos, anti-GAD, foram doseados pelo método de ELISA. O ADN genómico foi extraído à partir de sangue total periférico e tipagem genética foi realizada mediante PCR-SSP.O alelo DQB1*02 (DQ2/DQ2) (p=0,033, OR= 4, IC (1,2-13,3) foi associado a susceptibilidade da DM1; os alelos DQB1*06 (DQ6/DQ6) (p=0,000, OR=0,30, IC (0,17-0,54); *11 (p=0,011, OR=0,14, IC=0,032-0,62); *13 (p=0,006, OR=0,13, IC=0,049-0,588) e *15 (p=0,001, OR=0,044, IC=0,005-0,39) foram associados a proteção. Foi encontrado 29,2% de positividade para o anti-GAD, não houve associação significativa (p=0,69) entre a resposta positiva do anti-GAD e a idade. Não foi encontrada associação significativa (p=0,39) entre o tempo de diagnóstico e resposta humoral. Observou-se associação significativa entre os alelos de risco DQB1*02 (p=0.000) e resposta positiva para anti-GAD; da mesma maneira houve uma associação significativa para os alelos DQB1*06 (p=0,002), DRB1*11 (p=0,048); *13 (p=0,004) e *15 (p=0,021) e a resposta negativa do anti-GAD.Os dados demostram o forte envolvimentos do gene HLA-II (DQ) com a suceptibilidade a DM1 e sugere que a autoimunidade se desenvolve na presença de susceptibilidade genética, quer dizer, em associação com alelos HLA-II específicos.

Biomarkers of Nitrosative Stress: Development and validation of a new analytical method for 3-Nitrotyrosine quantification

Background: The nitration of tyrosine residues in proteins is associated with nitrosative stress, resulting in the formation of 3-nitrotyrosine (3-NT). 3-NT levels in biological samples have been associated with numerous physiological and pathological conditions. For this reason, several attempts have been made in order to develop methods that accurately quantify 3-NT in biological samples. Regarding chromatographic methods, they seem to be very accurate, showing very good sensibility and specificity. However, accurate quantification of this molecule, which is present at very low concentrations both at physiological and pathological states, is always a complex task and a target of intense research. Objectives: We aimed to develop a simple, rapid, low-cost and sensitive 3-NT quantification method for use in medical laboratories as an additional tool for diagnosis and/or treatment monitoring of a wide range of pathologies. We also aimed to evaluate the performance of the HPLC-based method developed here in a wide range of biological matrices. Material and methods: All experiments were performed on a Hitachi LaChrom Elite® HPLC system and separation was carried out using a Lichrocart® 250-4 Lichrospher 100 RP-18 (5μm) column. The method was further validated according to ICH guidelines. The biological matrices tested were serum, whole blood, urine, B16 F-10 melanoma cell line, growth medium conditioned with the same cell line, bacterial and yeast suspensions. Results: From all the protocols tested, the best results were obtained using 0.5% CH3COOH:MeOH:H2O (15:15:70) as the mobile phase, with detection at wavelengths 215, 276 and 356 nm, at 25ºC, and using a flow rate of 1 mL/min. By using this protocol, it was possible to obtain a linear calibration curve (correlation coefficient = 1), limits of detection and quantification in the order of ng/mL, and a short analysis time (<15 minutes per sample). Additionally, the developed protocol allowed the successful detection and quantification of 3-NT in all biological matrices tested, with detection at 356 nm. Conclusion: The method described in this study, which was successfully developed and validated for 3-NT quantification, is simple, cheap and fast, rendering it suitable for analysis in a wide range of biological matrices.