Dissecting the role of CLASP1 in the mammalian development

A mitose é o evento celular, através do qual uma células transmite uma cópias do seu DNA às células filhas. Este processo é mediado pelo fuso mitótico, o qual consiste numa rede bipolar microtubulos. A dinâmica dos microtubulos é regulada por proteínas associadas a estes (MAPs – Microtubule-Associated Proteins), tais como as proteínas associadas às extremidades positivas dos microtubulos (+TIPs – Plus-ends Tracking proteins). As proteínas associadas às CLIPs (CLASPs – CLIP-associated proteins) pertencem a esta família e estão altamente conservadas nos eucariotas. Estas interagem com os microtubulos regulando o fuso mitótico, a segregação dos cromossomas e o comportamento dos microtubulos ao nível do cinetocoro. Assim, as CLASPs têm sido descritas como essenciais à manutenção da integridade genética durante a divisão celular. Um modelo animal knockout para o gene Clasp1 é uma ferramenta indispensável à descoberta do papel da CLASP1 a nível fisiológico. Nos animais knockout foi observado um fenótipo letal, no qual 100% dos recém-nascidos morreram poucos minutos após o nascimento, no decurso de falência respiratória. Após análise histopatológica, observamos que os pulmões dos animais knockout apresentam um atraso no desenvolvimento. Porém, a análise da expressão de marcadores de diferenciação celular, mostrou que os pneumócitos tipo I e II estão presente e diferenciados nos animais knockout aquando do seu nascimento. No entanto, um defeito primário a nível pulmonar ainda não pode ser excluído. Níveis elevados de glicogénio no parênquima alveolar dos animais knockout sugerem imaturidade pulmonar ou deficiente produção do líquido surfactante. Adicionalmente, ainda não está esclarecido de que forma pode este atraso explicar a letalidade observada nos recémnascidos knockout. Verificamos também que expressão de CLASP1 é transiente ao longo do desenvolvimento, sendo particularmente elevada no cérebro, o que pode explicar o seu papel já descrito na biologia dos neurónios. A CLASP1 é ubiquamente expressa em mamíferos adultos, o que sugere que esta proteína é também importante em tecidos diferenciados. Nesta fase, o significado biológico da CLASP1 em mamíferos ainda não foi descortinado. No entanto, nenhum animal knockout para Clasp1 foi capaz de sobreviver ex uterus, o que sugere um papel fundamental desta proteína na fase final do desenvolvimento dos mamíferos.

Macrociclos tetrapirrólicos e produtos de contraste iodados: uma nova abordagem

O trabalho descrito no presente documento reporta a preparação de derivados tetrapirrólicos iodados de tipo porfirina tornando-os potenciais veículos a meio de contraste iodado, usado em radiodiagnóstico. Com os resultados deste trabalho irá ser realizado um pedido de patente das moléculas e portanto, o acesso a este trabalho será restrito nos termos do Código da Propriedade Industrial, aprovado pelo Decreto de Lei nº 36/2003 de 5 de Março. Na primeira fase do trabalho, foi sintetizado o derivado porfirínico simétrico, meso-substituído, contendo um total de 8 iodos. Este foi preparado por condensação do pirrol e do aldeído iodado em meio ácido e na presença de nitrobenzeno. Foram ainda preparados as respetivas metaloporfirinas contendo os iões metálicos de manganês e gadolínio. Posteriormente foi avaliada a capacidade destes derivados atenuarem o feixe de raio-X, através da mediação das Unidades de Hounsfield, após serem adquiridas imagens por Tomografia Computorizada. Na segunda fase do trabalho procedeu-se ao estudo da influência destes compostos na diferenciação celular, usando como modelo as células de pré-adipócitos 3T3-L1. Foi avaliada a diferenciação celular, através da quantificação de lípidos das células maduras, marcados com Red Oil O, por espectrofotometria de Visível 3 e 10 dias após a administração dos derivados em estudo.

Macrophages as biomarkers in BCG treatment response in bladder cancer

Bladder cancer is a common urologic cancer and the majority has origin in the urothelium. Patients with intermediate and high risk of recurrence/progression bladder cancer are treated with intravesical instillation with Bacillus Calmette-Guérin, however, approximately 30% of patients do not respond to treatment. At the moment, there are no accepted biomarkers do predict treatment outcome and an early identification of patients better served by alternative therapeutics. The treatment initiates a cascade of cytokines responsible by recruiting macrophages to the tumor site that have been shown to influence treatment outcome. Effective BCG therapy needs precise activation of the Th1 immune pathway associated with M1 polarized macrophages. However, tumor-associated macrophages (TAMs) often assume an immunoregulatory M2 phenotype, either immunosuppressive or angiogenic, that interfere in different ways with the BCG induced antitumor immune response. The M2 macrophage is influenced by different microenvironments in the stroma and the tumor. In particular, the degree of hypoxia in the tumors is responsible by the recruitment and differentiation of macrophages into the M2 angiogenic phenotype, suggested to be associated with the response to treatment. Nevertheless, neither the macrophage phenotypes present nor the influence of localization and hypoxia have been addressed in previous studies. Therefore, this work devoted to study the influence of TAMs, in particular of the M2 phenotype taking into account their localization (stroma or tumor) and the degree of hypoxia in the tumor (low or high) in BCG treatment outcome. The study included 99 bladder cancer patients treated with BCG. Tumors resected prior to treatment were evaluated using immunohistochemistry for CD68 and CD163 antigens, which identify a lineage macrophage marker and a M2-polarized specific cell surface receptor, respectively. Tumor hypoxia was evaluated based on HIF-1α expression. As a main finding it was observed that a high predominance of CD163+ macrophage counts in the stroma of tumors under low hypoxia was associated with BCG immunotherapy failure, possibly due to its immunosuppressive phenotype. This study further reinforces the importance the tumor microenvironment in the modulation of BCG responses.

Characterization of the effects of antiepileptic drugs on bone metabolism: in vitro studies with human osteoblastic and osteoclastic cells

Bone is constantly being molded and shaped by the action of osteoclasts and osteoblasts. A proper equilibrium between both cell types metabolic activities is required to ensure an adequate skeletal tissue structure, and it involves resorption of old bone and formation of new bone tissue. It is reported that treatment with antiepileptic drugs (AEDs) can elicit alterations in skeletal structure, in particular in bone mineral density. Nevertheless, the knowledge regarding the effects of AEDs on bone cells are still scarce. In this context, the aim of this study was to investigate the effects of five different AEDs on human osteoclastic, osteoblastic and co-cultured cells. Osteoclastic cell cultures were established from precursor cells isolated from human peripheral blood and were characterized for tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity, number of TRAP+ multinucleated cells, presence of cells with actin rings and expressing vitronectin and calcitonin receptors and apoptosis rate. Also, the involvement of several signaling pathways on the cellular response was addressed. Osteoblastic cell cultures were obtained from femur heads of patients (25-45 years old) undergoing orthopaedic surgery procedures and were then studied for cellular proliferation/viability, ALP activity, histochemical staining of ALP and apoptosis rate. Also the expression of osteoblast-related genes and the involvement of some osteoblastogenesis-related signalling pathways on cellular response were addressed. For co-cultured cells, osteoblastic cells were firstly seeded and cultured. After that, PBMC were added to the osteoblastic cells and co-cultures were evaluated using the same osteoclast and osteoblast parameters mentioned above for the corresponding isolated cell. Cell-cultures were maintained in the absence (control) or in the presence of different AEDs (carbamazepine, gabapentin, lamotrigine, topiramate and valproic acid). All the tested drugs were able to affect osteoclastic and osteoblastic cells development, although with different profiles on their osteoclastogenic and osteoblastogenic modulation properties. Globally, the tendency was to inhibit the process. Furthermore, the signaling pathways involved in the process also seemed to be differently affected by the AEDs, suggesting that the different drugs may affect osteoclastogenesis and/or osteoblastogenesis through different mechanisms. In conclusion, the present study showed that the different AEDs had the ability to directly and indirectly modulate bone cells differentiation, shedding new light towards a better understanding of how these drugs can affect bone tissue.

Avaliação Diagnóstica e Diferenciação Pedagógica: dispositivos orientadores da aprendizagem

Este estudo teve como objetivo geral conhecer as representações de encarregados de educação e alunos sobre os contributos da avaliação diagnóstica para a implementação de estratégias de diferenciação pedagógica, nas aulas de Inglês das Atividades de Enriquecimento Curricular, as quais contribuíram para compreender a relação existente entre estes dois conceitos e a aquisição de aprendizagens por parte dos alunos Tratou-se de um projeto de investigação-ação que recorreu a uma metodologia de natureza qualitativa em que os dados foram recolhidos através de inquéritos por questionário e por entrevista, bem como através de observações realizadas antes e durante a intervenção na turma. O projeto teve como principais referentes teórico-conceptuais a literatura científica, produzida tanto em Portugal como no estrangeiro, que aborda as temáticas em estudo e o quadro legislativo em vigor no sistema educativo português. A componente empírica do estudo desenvolveu-se com uma turma de vinte e três alunos e no contexto específico de ensino e aprendizagem de Inglês precoce, nas Atividades de Enriquecimento Curricular. O presente estudo contribuiu para se perceber a relação existente entre a avaliação diagnóstica e a diferenciação pedagógica, bem como a sua influência positiva no processo de ensino e aprendizagem.