Construção de um biossensor para o doseamento de ureia baseado na inibição enzimática da amidase de pseudomonas aeruginosa com recurso a um eléctrodo selectivo de iões amónio

Era objectivo do presente trabalho o desenvolvimento de um biossensor baseado na inibição da amidase de Pseudomonas aeruginosa para a quantificação de ureia em diversas amostras com recurso a um eléctrodo selectivo de iões amónio (ISE). A ureia é um poderoso inibidor do centro activo da amidase (Acilamida hidrolase EC 3.5.1.4) de Pseudomonas aeruginosa a qual catalisa a hidrólise de amidas alifáticas produzindo o ácido correspondente e amónia. O extracto celular de Pseudomonas aeruginosa L10 contendo actividade de amidase foi imobilizado em membranas de poliétersulfona modificadas (PES) e em membranas de nylon Porablot NY Plus na presença de gelatina e de glutaraldeído (GA) como agente bifuncional. Estas membranas foram posteriormente utilizadas na construção do biossensor baseado no ISE, utilizando acetamida como substrato, a reacção enzimática foi seguida medindo os iões amónio produzidos pela hidrólise da amida alifática, e a resposta do biossensor apresentada como a velocidade inicial da reacção (mV.min-1). A optimização dos parâmetros de imobilização foi efectuada de acordo com a metodologia ANOVA. Assim, a mistura de 30μL extracto celular, 2μL GA (5%) e 10 μL Gelatina 15% (p/v) foi a que conduziu a uma melhor resposta do biossensor. Efectuou-se ainda o estudo de optimização de alguns parâmetros experimentais pH e tempo de incubação em ureia, este conduziu ao valor pH=7,2 como pH óptimo de resposta do biossensor e 20 min como tempo óptimo de incubação das membranas nas soluções de ureia, sendo neste caso a resposta do biossensor dada pela diferença das respostas do biossensor antes e após incubação. A calibração do biossensor foi efectuada em soluções contendo concentrações conhecidas de ureia preparadas em tampão Tris, leite e vinho caseiro, exibindo um limite de detecção de 2,0 ×10-6 M de ureia. A incubação das membranas em hidroxilamina 2M por um período de 2h permitiu a recuperação de 70% da actividade enzimática da membrana. O biossensor apresentou uma elevada estabilidade de armazenamento por um período de 55 dias revelando uma perda de apenas 15% da sua resposta. O biossensor desenvolvido apresenta uma sensibilidade de 58,245 mV.min-1 e um tempo de resposta de aproximadamente 20s. A resposta do biossensor foi linear para concentrações de ureia presentes no vinho na gama de 4-10 μM de ureia.

Valores de referência de robustez óssea avaliados próximo ao nascimento por ultrassonografia quantitativa em recém-nascidos de termo e pré-termo

Objectivo: Estabelecer valores de referência da robustez óssea nos primeiros dias de vida, em recém-nascidos de termo e pré-termo adequados para a idade de gestação nascidos em Portugal. Métodos: Foi medida a velocidade do som (VdS) (m/s) por ultrassonografia quantitativa, numa amostra sistemática de recém-nascidos adequados para a idade de gestação, de termo e pré-termo, respectivamente nos primeiros dois e cinco dias após o nascimento. Foi avaliada a homogeneidade de valores entre géneros e entre grupos de idade de gestação. Resultados: A amostra constou de 158 recém-nascidos, 34 de termo e 124 pré-termo (idade de gestação entre 26 a 41 semanas), com peso de nascimento de 595 g a 4195 g, 84 do sexo masculino (53,2%) e 20 gémeos (10,8%). A média da VdS aumenta significativamente com a idade de gestação. São providenciados valores de referência da VdS para os percentis 10, 25, 50, 75 e 90, para grupos de idade de gestação, sem distinção para o género. Conclusão: São disponibilizados valores de referência de VdS nos primeiros dias de vida, de recém-nascidos adequados para a idade de gestação, de termo e pré-termo, nascidos em Portugal. Estes valores reflectem a robustez óssea intrauterina e servem de referência basal para estudos evolutivos realizados em Portugal.

Mineralização óssea em recém-nascidos pré-termo com diferente suprimento parentérico de cálcio e fósforo: resultados preliminares

Introdução: Os recém-nascidos pré-termo estão em risco acrescido de desenvolver osteopénia, pela dificuldade no suprimento parentérico de aporte mineral suficiente. Existe uma grande amplitude de doses de cálcio e fósforo recomendadas para estes recém-nascidos por via parentérica, havendo também um elevado risco de precipitação mineral nestas soluções. A ultrassonografia quantitativa é um método recentemente utilizado para avaliação da mineralização óssea em recém-nascidos pré-termo. Objectivo: Medir a mineralização óssea a recém-nascidos pré-termo submetidos a nutrição parentérica com duas doses diferentes doses de cálcio e fósforo. Métodos: Foram incluídos recém-nascidos pré-termo (IGd<33semanas) consecutivos, com necessidade de aporte nutricional parentérico, que foram aleatorizados para receber um aporte parentérico diário de cálcio de 40-50mg.kg-1 (1,00-1,25 mmol.kg-1) (grupo Convencional) ou 70-80mg.kg-1 (1,75-2,00mmol.dl-1) (grupo Alta). Foi mantida a razão mássica Ca:P de 1,7:1 nos dois grupos. Foram efectuadas medições semanais por ultrassonografia quantitativa no ponto médio da tíbia, até serem atingidas as 40 semanas de idade de gestação corrigida. Estabeleceu-se um outro grupo (Controlo) referente apenas à mineralização óssea na primeira semana de vida de recém-nascidos (IGd<40 semanas), para reflectir a mineralização intrauterina. Resultados: Foram incluídos 19 recém-nascidos (grupo Convencional=7, grupo Alta=12), com (média±DP) IG 30,4±1.9 semanas e peso à nascença 1360±400g. Os recém-nascidos inclídos no grupo convencional apresentaram uma mineralização óssea significativamente inferior à dos controlos, o que não ocorreu quando comparados os grupos alta e controlo (para as 32 semanas de idade de gestação corrigida). Os recém-nascidos do grupo Convencional apresentaram ainda mineralização óssea significativamente mais baixa na terceira semana pós-natal, comparativamente com o grupo Alta (p=0,030). Conclusões: A manter-se a tendência, talvez haja um efeito benéfico de uma dose parentérica mais elevada de cálcio e fósforo na mineralização óssea de RNs pré-termo sem o risco de nefrocalcinose. A mineralização óssea intrauterina parece ser superior à do recém-nascido submetido a nutrição parentérica sem manipulação do seu aporte mineral; no entanto, a utilização de soluções parentéricas enriquecidas em minerais ósseos parece provocar uma mineralização óssea semelhante à adquirida no útero.