Construção de um biossensor para o doseamento de ureia baseado na inibição enzimática da amidase de pseudomonas aeruginosa com recurso a um eléctrodo selectivo de iões amónio

Era objectivo do presente trabalho o desenvolvimento de um biossensor baseado na inibição da amidase de Pseudomonas aeruginosa para a quantificação de ureia em diversas amostras com recurso a um eléctrodo selectivo de iões amónio (ISE). A ureia é um poderoso inibidor do centro activo da amidase (Acilamida hidrolase EC 3.5.1.4) de Pseudomonas aeruginosa a qual catalisa a hidrólise de amidas alifáticas produzindo o ácido correspondente e amónia. O extracto celular de Pseudomonas aeruginosa L10 contendo actividade de amidase foi imobilizado em membranas de poliétersulfona modificadas (PES) e em membranas de nylon Porablot NY Plus na presença de gelatina e de glutaraldeído (GA) como agente bifuncional. Estas membranas foram posteriormente utilizadas na construção do biossensor baseado no ISE, utilizando acetamida como substrato, a reacção enzimática foi seguida medindo os iões amónio produzidos pela hidrólise da amida alifática, e a resposta do biossensor apresentada como a velocidade inicial da reacção (mV.min-1). A optimização dos parâmetros de imobilização foi efectuada de acordo com a metodologia ANOVA. Assim, a mistura de 30μL extracto celular, 2μL GA (5%) e 10 μL Gelatina 15% (p/v) foi a que conduziu a uma melhor resposta do biossensor. Efectuou-se ainda o estudo de optimização de alguns parâmetros experimentais pH e tempo de incubação em ureia, este conduziu ao valor pH=7,2 como pH óptimo de resposta do biossensor e 20 min como tempo óptimo de incubação das membranas nas soluções de ureia, sendo neste caso a resposta do biossensor dada pela diferença das respostas do biossensor antes e após incubação. A calibração do biossensor foi efectuada em soluções contendo concentrações conhecidas de ureia preparadas em tampão Tris, leite e vinho caseiro, exibindo um limite de detecção de 2,0 ×10-6 M de ureia. A incubação das membranas em hidroxilamina 2M por um período de 2h permitiu a recuperação de 70% da actividade enzimática da membrana. O biossensor apresentou uma elevada estabilidade de armazenamento por um período de 55 dias revelando uma perda de apenas 15% da sua resposta. O biossensor desenvolvido apresenta uma sensibilidade de 58,245 mV.min-1 e um tempo de resposta de aproximadamente 20s. A resposta do biossensor foi linear para concentrações de ureia presentes no vinho na gama de 4-10 μM de ureia.

Determinação do azoto total num adubo (nitrato de cálcio e amónio) por termogravimetria

A acentuada diminuição da área arável per capita nas últimas décadas exige uma maior produtividade para os terrenos agrícolas. O acréscimo na produtividade é em parte conseguido pelo uso de adubos orgânicos e/ou inorgânicos. O consumo e consequente produção de adubos acompanham a tendência ditada pela necessidade de maximizar a produção agrícola. Recentes normas europeias exigem um controlo de qualidade rigoroso para os adubos em geral e em particular para os que tem um elevado teor em azoto. Para o nitrato de cálcio e amónio (NCa), essencial para a cultura de cereais, os teores em azoto nítrico e amoniacal tem de ser rigorosamente controlados dado que o nitrato de amónio pode ser usado na produção de explosivos. Na indústria o controlo de qualidade do NCa é feito por técnicas de análise volumétrica morosas e dispendiosas. Com o objectivo de seleccionar uma técnica mais expedita para o controlo de qualidade do NCa, várias amostras (sólidos granulares) comercializadas em Portugal e algumas de origem nórdica foram caracterizadas por difracção de raios x, espectroscopia do infravermelho por reflectância e termogravimetria. Todas as amostras foram previamente peneiradas de forma a obter a sua distribuição granulométrica. A difracção de raios X confirmou que as amostras eram semi-cristalinas, o que era previsível em face do processo de produção. A baixa cristalinidade não permitiu o cálculo dos parâmetros da rede cristalina que indicariam, ou não, a formação do sal duplo. A espectroscopia do infravermelho permitiu a identificação das bandas correspondentes aos dois nitratos. Os resultados da termogravimetria permitiram identificar os processos de desidratação e de decomposição dos dois nitratos. Numa só análise foi possível quantificar a água de cristalização, o azoto nítrico, o azoto amoniacal e o teor em CaO das amostras. Os resultados obtidos por termogravimetria mostraram elevada coerência com os análogos obtidos pelas técnicas clássicas de análise volumétrica. O teor em água de cristalização, obtido por TG, concorda com a estequiometria prevista para o nitrato duplo de cálcio e amónia (10 moléculas de água de hidratação). As réplicas efectuadas mostraram excelente reprodutibilidade da análise termogravimétrica das amostras de NCa. Não obstante o investimento inicial necessário, a termogravimetria afigura-se uma solução expedita para o controlo de qualidade do NCa na indústria.