Efeitos estruturais e cinéticos de micelas invertidas sobre uma amidase de pseudomonas aeruginosa

No presente trabalho foi executado o encapsulamento de células intactas, extracto celular e amidase purificada (E.C. 3.5.1.4) da estirpe L10 e AI3 de Pseudomonas aeruginosa num sistema de micelas invertidas composto pelo surfactante catiónico brometo de tetradeciltrimetilamónio (TTAB) em heptano/octanol 80/20 (v/v). O efeito do encapsulamento no sistema de micelas invertidas foi estudado avaliando a reacção de transamidação para síntese de ácido acetohidroxâmico, catalisada pela amidase expressa por ambas as estirpes. No sistema de micelas invertidas fez-se variar conteúdo de água (w0) e foi estudado o efeito na actividade enzimática e no rendimento de síntese de acetohidroxamato. Os resultados demonstraram um aumento considerável de actividade específica e do rendimento de síntese no sistema de micelas comparativamente ao meio convencional aquoso, sugerindo que a metodologia de encapsulamento do biocatalisador demonstrou potencialidades de utilização na síntese de hidroxamatos, compostos de elevada importância e aplicabilidade. Na variação do conteúdo de água no sistema micelar obteve-se uma curva em sino de actividade específica e de rendimento, com um pico de actividade para w0 = 10, quer em células intactas, extracto celular e amidase purificada de ambas as estirpes. No caso da Pseudomonas aeruginosa L10 alcançaram-se actividades específicas de 8, 11 e 103 UI/mg de proteína e rendimentos de 94, 99 e 40 % respectivamente para células intactas, extracto celular e amidase purificada. Quanto à Pseudomonas aeruginosa AI3 obtiveram-se, respectivamente, actividades específicas de 5, 9 e 163 UI/ mg de proteína e rendimentos de 66, 66 e 28 % para células intactas, extracto celular e amidase purificada. A estabilidade de armazenamento do biocatalisador no sistema de micelas invertidas e em solução aquosa a 24ºC foi avaliada. Este estudo revelou um aumento do t1/2 no sistema de micelas face ao armazenamento em solução aquosa convencional. No caso da Pseudomonas aeruginosa L10 os melhores resultados foram obtidos para a amidase purificada encapsulada revelando um t1/2 de 17 dias. Quanto ao extracto celular da Pseudomonas aeruginosa AI3 demonstrou um t1/2 de 26 dias quando encapsulado no sistema de micelas. O estudo das alterações estruturais na amidase, de ambas as estirpes, devidas ao encapsulamento em micelas invertidas foi realizado recorrendo à espectroscopia de FTIR. Esta análise permitiu verificar que a amidase AI3 não alterou significativamente a sua estrutura secundária em micelas invertidas para diferentes w0. No entanto, no encapsulamento a sua estrutura secundária sofreu alterações face à estrutura do enzima em solução aquosa. A amidase L10 exibe apenas alterações estruturais face à estrutura que exibe em solução aquosa quando confinada em micelas para w0 3,5 e 4.

Análise da produção de uma amidase recombinante de pseudomonas aeruginosa

O presente trabalho consistiu na optimização da produção da amidase (EC.3.5.1.4 recombinante de Escherichia coli cujo gene foi isolado de Pseudomonas aeruginosa 8602. O efeito na agregação do enzima in vivo de diversos parâmetros de crescimento, tais como concentração de IPTG, temperatura de incubação e 3% de etanol, foi estudado por combinação da actividade enzimática com a espectrocospia de FTIR. Os resultados demosntraram que ocorreu a formação de amidase agregada na forma de corpos de inclusão em todas as condições de crescimento. A actividade enzimática máxima obtida na fracção solúvel ocorreu para a condição de 4,40 mM IPTG com etanol a 37º C enquanto que nas fracções insolúveis a actividade enzimática máxima obtida foi para a condição de 0,70mM IPTG com etanol a 25ºC. Verificou-se ainda que o etanol nas condições de crescimento de 25ºC permitiu uma elevada expressão de amidase, mas que agragou numa forma biologicamente activa apresentando para determinadas condições um aumento de 60% de actividade específica em relação à fracção solúvel. A espectrocospia de FTIR foi utilizada para o estudo de possíveis alterações estruturais da amidase produzida nas diversas condições de crescimento. Constatou-se assim que para todas as condições de crescimento, a amidase agregou na forma de corpos de inclusão devido ao aumento de folhas-β agregadas resultante de um aumento de interacções intermoleculares comparativamente ao enzima purificado. De um modo geral as condições a 25ºC formam maior quantidade de folhas-β agregadas que as condições a 37ºC, principalmente na presença de etanol. Verificou-se ainda que os corpos de inclusão das condições de crescimento de 37ºC apresentam uma estrutura secundária mais semelhante com a solução de amidase purificada relativamente às condições de 25ºC. No entanto as condições de 37ºC apresentam agragados com menor actividade possivelmente devido à ocorrência de interacções intermoleculares associadas a uma estrutura secundária mais semelhante à nativa. A solubilização não desnaturante da amidase nos corpos de inclusão foi efectuada com sucesso na presença de L-Arginina obtendo-se maior rendimento de solubilização para as condições a 37ºC, comprovando a menor quantidade de interacções intermoleculares nestes agregados e uma estrutura secundária do enzima agregado semelhante à nativa.

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