Desenvolvimento de novas metodologias para determinação de antibióticos em águas de consumo: estudo exploratório

Está hoje bem estabelecido que os antibióticos são constantemente libertados e introduzidos no meio ambiente em consequência da sua extensa utilização na medicina humana e veterinária. A presença destes compostos tem vindo a ser verificada, por diversos autores, em águas subterrâneas, águas de superfície e águas residuais. O impacto que deriva da acumulação destas substâncias a nível ambiental, nomeadamente, situações de toxicidade e/ou desenvolvimento de resistências bacterianas, impõe um controlo sobre a qualidade das águas no que respeita a estas substâncias. Este estudo pretende explorar a aplicabilidade da extracção por fase sólida (SPE) utilizando resinas de fase reversa C-18, para a determinação de tetraciclina (TC), cloranfenicol (CPA) e estreptomicina (STP) em amostras de água padronizadas. A separação cromatográfica foi elevada a cabo por cromatografia líquida de alta pressão com detector de fotodiodos (HPLC-DAD) empregando uma coluna C18 de fase reversa (30cm x 3.9mm, 5pm de tamanho partícula). A monitorização dos antibióticos foi realizada por um varrimento de comprimentos de onda específicos para cada um dos compostos (357, 277, e 257nm para TC, CPA e STP, respectivamente). O solvente de eluição constituiu um factor determinante na extracção dos antibióticos da resina utilizada, tendo sido conseguidas extracções máximas de 77,1% para a TC e de 15,3% para o CPA; não foi conseguida qualquer recuperação para a STP com a resina utilizada. Assim, o método revelou-se eficaz para a análise conjunta dos antibióticos CPA e TC, recomendando-se a análise da STP por um método separado, dada as suas elevadas características polares.

Cianobactérias e toxicidade: impacte na saúde pública em Portugal e no Brasil

Um aumento da concentração de nutrientes na água poderá desencadear fluorescências de cianobactérias (densidades >200 cel/mL). Sob determinadas condições as cianobactérias produzem toxinas responsáveis pelo envenenamento de animais e humanos. O objetivo deste estudo é relacionar a ocorrência de fluorescências toxicas em Portugal e no Brasil. Para tal, em 2005 e 2006 foi estudado o fitoplâncton em três reservatórios em Portugal (região sul) e dois no Brasil (Minas Gerais e Pará). Comparativamente foi verificado maior diversidade nos reservatórios portugueses, com dominância de cianobactérias em período de primavera/verão/outono, pertencentes a géneros produtores de hépato e neurotoxinas (Microcystis sp, Aphanizomenon sp, Oscillatoria sp e Planktothrix sp.). No Brasil observou-se dominância de cianobactérias ao longo de todo o ano, com presença de Microcystis aeruginosa, produtora de hepatotoxina. Conclui-se que os reservatórios estudados apresentam géneros produtores de toxinas, com risco para a saúde pública, sendo fundamental implementar medidas que contribuam para mitigar esta situação. - ABSTRACT - An increasing of nutrients in water can conduct to the development of cyanobacteria blooms (density>2000 cels/mL). Under specific conditions cyanobacteria produce toxins responsible for acute poisoning of animals and humans. The aim of this study is to describe toxic blooms in Portugal and Brazil. Therefore, phytoplankton from three Portuguese reservoirs (South region) and two from Brazil (Minas Gerais and Pará) were studied in 2005 and 2006. Portuguese reservoirs showed more diversity with dominance of hepatic and neurotoxin genera producers (Microcystis sp, Aphanizomenon sp, Oscillatoria sp e Planktothrix sp.) along spring/summer/autumn seasons. In Brazil dominance of cyanobacteria was observed all along the year with the presence of Microcystis aeruginosa hepatotoxic producer. The studied reservoirs present toxins producers’ genera, with risk for public health, being fundamental the implementation of mitigation measures to reverse this situation.

Toxicidade a cianobactérias: impacte potencial na saúde pública em populações de Portugal e Brasil

Como recurso natural fundamental à vida, a água e os ecossistemas aquáticos devem ser alvo de avaliação contínua, no que se reporta à sua qualidade física, química e biológica. Segundo a Organização Mundial de Saúde cerca de 1,1 biliões de pessoas estão impossibilitadas em aceder a qualquer tipo de água potável e, as populações residentes nas proximidades de rios, lagoas, e reservatórios utilizam estas águas para as suas necessidades de consumo, aumentando o risco de transmissão de doenças. Enquanto constituintes da comunidade fitoplanctónica, as cianobactérias são microrganismos procariotas, fotossintéticos, que obtêm os nutrientes diretamente da coluna de água e, um aumento da concentração de nutrientes (principalmente azoto e fósforo), associado a condições ambientais favoráveis, pode desencadear um crescimento rápido originando fluorescências. Sob determinadas condições as cianobactérias podem produzir toxinas existindo registos que evidenciam que fluorescências toxicas são responsáveis pelo envenenamento agudo e morte de animais e humanos pelo que, a água utilizada para consumo humano deverá ser regularmente monitorizada para este elemento biológico. O objetivo deste estudo é relacionar a ocorrência de fluorescências de cianobactérias (> 2000 cel/ml) e toxicidade associada, com o impacte potencial na Saúde Pública avaliado através do consumo direto ou indireto da água. Em Portugal foram selecionados oito reservatórios situados na região Sul, pertencentes às bacias hidrográficas do Sado e Guadiana e estudados entre 2000 e 2008. No Brasil foram selecionados os reservatórios de Três Marias (Estado de Minas Gerais) e de Tucuruí (Estado do Pará) e estudados em 2005 e 2006 respetivamente. Os reservatórios foram caracterizados em termos físicos e químicos, tendo-se igualmente procedido à caracterização da comunidade fitoplanctónica através da identificação e quantificação dos principais grupos presentes em diferentes épocas do ano. Em termos fitoplanctónicos os reservatórios portugueses apresentaram maior diversidade,verificando-se contudo dominância das cianobactérias na comunidade. Associados a fluorescências, foram registados nestes reservatórios géneros produtores de hepato e neurotoxinas como Aphanizomenon sp, Microcystis aeruginosa e Oscillatoria sp. No Brasil, em situação de fluorescências, os géneros produtores de neuro e hepatotoxinas foram Microcystis (> 350.000 cels/ml) e Cylindrospermopsis. A presença destes géneros, poderá constituir um risco potencial para a saúde pública, pelo que é importante a implementação de medidas de mitigação em todos os reservatórios objeto de estudo, devendo essa atuação passar pelo controle do estado trófico no sentido de evitar o desenvolvimento de fluorescências. Assim sugere-se a implementação de um tratamento adequado para a produção de água de consumo e a organização de ações de sensibilização e aviso e informação às populações que utilizam os reservatórios em Portugal e no Brasil para diversos usos. - ABSTRACT - As a life fundamental natural resource, water and aquatic ecosystems must be continuously evaluated in their physical, chemical and biological quality. According World Health Organization, 1.1 billion people has no chance to access any kind of potable water. Populations living near rivers, lagoons or reservoirs use those waters to content their needs, increasing risks disease transmission. As members of phytoplankton community, cyanobacteria are prokaryotic, photosynthetic microorganisms and get its nutrients directly from water column. The increase of this nutrients (especially nitrogen and phosphorus) associated with favorable environment conditions, can support a sudden grow and instigate blooms. Under specific conditions cyanobacteria can produce toxins and several records have shown that toxic blooms are responsible by acute poisoning and death in animals and humans so, water for human consumption must be regularly surveyed for this biologic element. The aim of this study is to correlate Cyanobacteria blooms (>2.000cels/ml) and connected toxicity with public health impact, evaluated through water consumption. In Portugal, eight reservoirs located in the South region were selected and study between 2000 and 2008. In Brazil, Três Marias reservoir (Minas Gerais Provence) and Tucuruí (Pará Provence) were selected and study in 2005 and 2006. Reservoirs were characterized in physical and chemical aspects, as well as phytoplankton community, through identification and counting of main present groups along study period. In bloom circumstances, liver toxins and neurotoxins producers like Aphanizomenon sp, Microcystis aeruginosa and Oscillatoria sp. were founded in Portuguese reservoirs. In Brazil, cyanobacteria genera involved in toxic bloom were Microcystis (> 350.000 cels/ml) and Cylindrospermopsis. This genera presence represents a potential risk for public health, and show the requirement to implement mitigation measures in all study reservoirs. These measures can be represented by water eutrophication control to avoid blooms, by appropriate treatments of water to human consumption, and public warnings or information to dose people in Portugal and Brazil that use these reservoirs to several activities.

Simulação de colunas de destilação de elevada eficiência energética

A destilação é o principal processo de separação usado nas indústrias químicas para separação de misturas líquidas, e apesar de ser um processo muito intensivo energeticamente continua hoje em dia a ser o processo de separação preferencial. O largo impacto dos processos de destilação nos custos de investimento e operação tem impulsionado o desenvolvimento de sistemas complexos de destilação, cuja principal finalidade consiste na otimização energética do processo de separação. No âmbito do estudo da utilização de colunas de elevada eficiência energética para separações multicomponente através da simulação de processos, o presente trabalho foca-se na compreensão, análise e avaliação da Coluna de Petlyuk, sistema de colunas com acoplamento térmico integral (FTCDC), inicialmente introduzida na década de 1940, com um reportado potencial para poupanças energéticas até cerca de 30% relativamente ao sistema tradicional. Para a simulação dos sistemas em estudo foi usado o software de simulação de processos HYSYS, cuja aplicação é desenvolvida e analisada no decurso deste trabalho, o qual é dividido em três partes principais: implementação dos processos em HYSYS para simulação rigorosa em modo de estado estacionário, otimização e simulação dinâmica e controlo. A primeira parte diz respeito ao design dos sistemas e âmbito de aplicação do HYSYS nesta etapa. Através do estudo da separação de mistura ternária equimolar de isómeros de butanol, é apresentado um procedimento de implementação do sistema FTCDC e avaliados os resultados de simulação rigorosa fazendo a sua comparação com os resultados obtidos para o sistema tradicional. A segunda parte é dedicada à otimização de ambos os sistemas, FTCDC e tradicional, cujos estudos se baseiam na simulação em estado estacionário. O elevado número de variáveis de design do sistema FTCDC pode conduzir a tedioso e moroso trabalho de simulação. Neste trabalho são aplicadas metodologias de desenho de experiências na otimização do sistema FTCDC, as quais permitiram uma significativa redução o número de simulações a executar, sendo o procedimento de otimização, baseado no procedimento de desenhos de experiências, desenvolvido ao longo desta parte. Os resultados de otimização de ambos os sistemas são avaliados e comparados. A última parte deste trabalho debruça-se sobre o tema da operabilidade dos sistemas, avaliada através da simulação dinâmica dos mesmos e avaliação da estrutura de controlo implementada. A simulação dinâmica de processos, baseada em modelos dinâmicos, permite melhorar o seu design, otimização e operação, cujos resultados traduzirão de uma forma mais realística o desempenho do processo desenhado, uma vez que estes nunca se encontram num verdadeiro estado estacionário. Nesta parte é apresentado o procedimento de implementação da simulação dinâmica de ambos os sistemas, no qual se inclui a definição da configuração de controlo para cada um destes. Através dos resultados de simulação dinâmica de ambos os sistemas é avaliado o seu design e respetiva estrutura de controlo.

Plantas ornamentais tóxicas: contributo para a sua caracterização e perceção do risco de exposição ocupacional

Mestrado em Segurança e Higiene do Trabalho.

Biodegradação enzimática de aminas aromáticas tóxicas

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica

O papel da auditoria no relato financeiro de matérias ambientais: estudo comparativo entre empresas cotadas na Euronext Lisbon e na NYSE Euronext

O objectivo principal da presente dissertação, é determinar o grau de cumprimento e controlo do relato financeiro, em termos de divulgação de matérias ambientais, das empresas cotadas Euronext Lisbon e na Nyse Euronext. Em termos de metodologia, efectuámos uma análise de conteúdo à informação contabilística, publicada pelas empresas-alvo no ano de 2007, utilizando as técnicas univariada, bivariada e multivariada. Por fim, construímos um índice baseado na análise das componentes principais. Depois de analisar quais os factores que mais influenciam o relato financeiro em termos de divulgação de matérias ambientais, chegámos à conclusão que o “Capital Próprio” está negativamente correlacionado com a certificação externa, quer para as empresas cotadas na Euronext Lisbon, quer para as empresas cotadas na Nyse Euronext. Já o factor “Resultado Líquido” está negativamente correlacionado, para as empresas cotadas na Euronext Lisbon, com as divulgações ambientais presentes no relatório de gestão, e positivamente correlacionado, para as empresas cotadas na Nyse Euronext, com a existência de um relatório de sustentabilidade. No que diz respeito ao factor “Volume de Negócios”, este encontra-se directamente relacionado, para as empresas cotadas na Euronext Lisbon, com as divulgações contabilísticas de matérias ambientais. Por seu lado, para as empresas cotadas na Nyse Euronext, as divulgações contabilísticas de matérias ambientais estão directamente relacionadas com o factor “Sector de Actividade”. Em termos de análise multivariada, agrupámos um conjunto de factores, relacionados com o cumprimento e controlo do relato financeiro de matérias ambientais, em quatro dimensões (“Melhoria da Divulgação e Certificação”, “Melhoria da Medição”, Melhoria da Qualidade”, e “Melhoria do Controlo”), com o intuito de compreender qual é considerada como mais importante aquando da construção deste tipo de informações, para cada um dos grupos estudados. Aqui, chegámos à conclusão que, para ambos os grupos, a atenção é mais focada para a “Melhoria da Divulgação e Certificação”. Relativamente ao índice global, construído a partir da análise multivariada efectuada, é unânime para ambos os grupos de empresas que a dimensão “Melhoria do Controlo” é a que se revela menos significante na divulgação de matérias ambientais. Na construção deste índice global, é notório que as empresas cotadas na Nyse Euronext, ainda que não possuam um normativo sobre o relato financeiro de matérias ambientais, obtém uma classificação mais elevada (0,33 versus 0,25), no que diz respeito ao seu controlo e cumprimento do relato financeiro de matérias ambientais, quando comparadas com as empresas cotadas Euronext Lisbon. Com os resultados obtidos, concluímos que as empresas cotadas na Euronext Lisbon têm um menor grau de controlo e cumprimento relativamente às empresas cotadas na Nyse Euronext, no que diz respeito à divulgação de matérias ambientais.

Trabalho em ambientes refrigerados: estudo de caso com a realização de monitorização ambiental e electrocardiográfica

Introdução - Em ambientes laborais de baixa temperatura ocorrem reacções fisiológicas destinadas a ajustar o equilíbrio térmico que podem conduzir a sobrecarga cardiovascular. Contudo, em várias áreas de actividade o frio é um factor essencial para a produção, o que torna a exposição ocupacional uma realidade incontornável. Este estudo teve como objectivo identificar alterações electrocardiográficas em trabalhadores de uma Indústria de Processamento de Carnes (IPC), em condições laborais de baixa temperatura (<8ºC) e caracterizar o ambiente térmico. Metodologia - Foram medidos por equipamento específico os parâmetros ambientais (temperatura, humidade relativa e velocidade do ar). Foram calculados o índice IREQ (isolamento requerido pelo vestuário) e o nível de actividade metabólica por posto de trabalho. A monitorização electrocardiográfica foi efectuada através de electrocardiografia ambulatória de Holter (EcgAH). Para recolha de dados complementares ao EcgAH, foram também utilizados um diário de EcgAH, um questionário e um termómetro digital. Resultados/Discussão - A amostra em estudo estava sujeita a um grau hipotérmico ligeiro, podendo dever-se à ausência de exposição a stress térmico e à confluência de factores como: a elevada percentagem de trabalhadores que utiliza vestuário adicional além do protector cedido pela IPC e a elevada taxa metabólica inferida pela análise da frequência cardíaca. Os resultados deste estudo divergiram dos da literatura consultada, não se identificando qualquer expressão electrocardiográfica comum na hipotermia. Considerações finais - Sugere-se a implementação de algumas medidas de carácter organizacional uma vez que, por questões produtivas, é impossível alterar as condições térmicas. Apesar de não se terem identificado alterações electrocardiográficas, considera-se pertinente integrar exames do foro cardiovascular (para além do electrocardiograma, também o electrocardiograma ambulatório de Holter, a medição ambulatória da pressão arterial e ecocardiograma) nos exames realizados no âmbito da medicina do trabalho, pois ambientes refrigerados podem promover alterações a nível cardíaco.

Bobinas de radiofrequência em estudos mamários por ressonância magnética: modelos e qualidade de imagem

Em três equipamentos de Ressonância Magnética [1,5T] avaliaram-se e compararam-se 3 modelos de bobinas dedicadas para estudos mamários. A variável qualidade de imagem foi avaliada quantitativamente através dos indicadores: (i) relação entre o sinal e o ruído (SNR) e (ii) uniformidade do sinal (U). Na avaliação qualitativa consideram-se as variáveis: (iii) conforto proporcionado às voluntárias durante o exame, (iv) acessibilidade à mama para procedimentos de intervenção, (v) manipulação e posicionamento pelos Técnicos de Radiologia, (vi) possibilidade de selecção uni ou bilateral na aquisição da imagem e (vii) orientação da paciente dentro do magneto. Para a obtenção das imagens, 3 mulheres voluntárias, sem história conhecida de patologia mamária que representavam os padrões mamários 1, 2 e 3 da classificação BIRADS (35, 53 e 72 anos) foram submetidas a uma sequência RM utilizando-se a técnica de saturação espectral da gordura (SPIR), em ponderação T2. Procedeu-se a uma análise de variância factorial com cinco factores fixos sem réplicas e verificou-se que existiam diferenças significativas nas imagens relativamente aos valores médios da SNR e U nas três bobinas [SNR (valor-p=0, F=277,193) e U (valor-p=0, F=1487,95)]. A análise das comparações múltiplas de Tukey, permitiu verificar que existem diferenças significativas entre os valores médios da SNR e da U entre todas as combinações de pares de bobinas, sendo a bobina Z a que apresentou os valores médios da SNR e da U significativamente mais elevados [SNR (15,08u.a.) e U (0,58u.a.)] e, por isso, permitindo obter melhores imagens. Quanto à bobina X verificaram-se os valores de (SNR=4,77 e U=0,30u.a.) e para a bobina Y o SNR (2u.a.) e a U (0,06u.a). Verificou-se que a posição da ROI nos procedimentos de medida (correlação de Spearman) não influencia a qualidade da imagem (valor-p≥0 em todas as bobinas). A classificação mais elevada relativamente ao conforto foi atribuída à bobina X, seguindo-se a bobina Z. A escolha do modelo da bobina é importante para promover o aumento da qualidade das imagens, do conforto da paciente e manipulação nas manobras de posicionamento. Este estudo poderá contribuir como regulador dos aspectos financeiros e comerciais desenvolvidos entre marcas concorrentes no mercado.

Exposição profissional a formaldeído: que realidade em Portugal?

Introdução – O formaldeído está enquadrado entre as 25 substâncias químicas mais abundantemente produzidas no mundo devendo-se essencialmente à sua elevada reactividade, ausência de cor, à sua pureza no formato comercial e, ainda, ao seu baixo custo. A IARC, desde 2006, classifica o formaldeído no Grupo 1 (agente carcinogénico) com base na evidência de que a exposição a formaldeído é susceptível de causar cancro nasofaríngeo em humanos. Desenvolveu-se um estudo de natureza exploratóra com o objectivo essencial de obter informação sobre a realidade da exposição profissional a formaldeído em Portugal. Igualmente, pretendeu-se conhecer a adequabilidade de uma nova metodologia de monitorização ambiental ao estudo da exposição ocupacional a formaldeído. Metodologia – Realizaram-se várias medições das concentrações de formaldeído em 7 unidades industriais e num laboratório hospitalar de anatomia patológica. As avaliações ambientais foram concretizadas com recurso a um equipamento de leitura directa que realiza a medição por Photo Ionization Detection (PID), com uma lâmpada de 11,7 eV. Resultados – No laboratório de anatomia patológica estudado foram registados valores de concentração superiores ao valor-limite de referência (0,3 ppm). Igualmente, em 2 das 7 unidades industriais estudadas foram registados valores de concentração máxima superiores a 0,3 ppm. Conclusões – Em consonância com outros estudos, o laboratório de anatomia patológica apresentou-se como o contexto ocupacional onde a exposição a formaldeído apresenta as concentrações mais elevadas. A metodologia adoptada para monitorização ambiental parece adequar-se aos objectivos da presente investigação e relacionada com o modo de actuação do agente químico em estudo.

Análise da mobilidade de pessoas com deficiência: estudo de caso

Nos dias que decorrem assiste-se, nos países desenvolvidos, a um aumento da esperança média de vida, que se traduz num maior número de pessoas idosas e com maiores probabilidades de apresentarem algum tipo de limitação da mobilidade. Por outro lado, devido à sinistralidade rodoviária, principalmente quando ocorre em meios urbanos, surgem todos os anos muitas vítimas entre os peões por serem mais vulneráveis. Embora seja uma realidade presente nas cidades portuguesas, os dados disponibilizados pela Autoridade Nacional de Segurança Rodoviária, evidenciam um decréscimo constante da sinistralidade nas últimas duas décadas. Quando não resultam em vítimas mortais, há uma elevada percentagem destes cidadãos que fica com algum tipo de problema que restringe (ou impede) de algum modo a liberdade dos seus movimentos. Não só para aqueles que, por motivos vários, se deparam com uma nova realidade nas suas vidas (temporária ou permanentemente), como para todos aqueles que já nasceram com algum tipo de limitação, nomeadamente os portadores de deficiência física, torna-se urgente adaptar todos os espaços e edifícios que integram os meios urbanos de modo a proporcionar a todos os cidadãos as mesmas oportunidades de usufruir dos mesmos, concentrando esforços num objectivo comum: a eliminação dos obstáculos à mobilidade como forma de combater a exclusão social destes grupos particulares de cidadãos. É em torno desta temática que se desenvolve todo o presente trabalho, que visa de um modo geral averiguar o estado da arte em Portugal, concentrando-se a análise na Cidade de Lisboa. Perante a situação encontrada, constata-se que têm vindo a ser realizadas diversas intervenções a vários níveis com o objectivo de transformar Lisboa numa cidade acessível a todos os cidadãos, no entanto, e apesar do esforço conjunto das entidades competentes, continuam a verificar-se muitas situações por resolver, encontrando-se referida adaptação ainda distante de abranger a totalidade da cidade.

Patologia em fachadas com revestimentos de ladrilhos cerâmicos

O objectivo geral desta dissertação é o conhecimento mais abrangente dos ladrilhos cerâmicos, como elemento singular da construção de edifícios em Portugal, visto que há grande tradição na utilização de ladrilhos colados como revestimento de fachadas, sistema que tem uma elevada durabilidade quando correctamente concebido e aplicado. Outro objectivo será a discrição das patologias e as presumíveis causas da sua ocorrência. Nesse sentido, e para melhor conhecer o seu comportamento faz-se uma caracterização dos revestimentos cerâmicos em fachadas de edifícios, descreve-se em seguida o conteúdo do projecto de revestimentos cerâmicos aderentes, as suas especificações e as condições técnicas exigíveis na sua aplicação. As patologias inerentes ao não cumprimento das condições necessárias à sua boa aplicação e a escolha para o fim pretendido foram identificadas, bem como as suas origens e soluções de reabilitação. Verificando-se a necessidade de avaliações e inspecções periódicas das fachadas, elaborou-se uma ficha de avaliação e inspecção como contributo para garantir a durabilidade e o bom desempenho deste material ao longo da sua vida útil. Através da base de dados recolhida em inspecções visuais a edifícios com revestimentos cerâmicos e com recurso à ficha de inspecção de avaliação e inspecção, desenvolveu-se uma metodologia para quantificação e classificação das anomalias do revestimento, recolha e tratamento de informação de campo dos revestimentos cerâmicos no sentido de analisar o seu comportamento.

Efeitos estruturais e cinéticos de micelas invertidas sobre uma amidase de pseudomonas aeruginosa

No presente trabalho foi executado o encapsulamento de células intactas, extracto celular e amidase purificada (E.C. 3.5.1.4) da estirpe L10 e AI3 de Pseudomonas aeruginosa num sistema de micelas invertidas composto pelo surfactante catiónico brometo de tetradeciltrimetilamónio (TTAB) em heptano/octanol 80/20 (v/v). O efeito do encapsulamento no sistema de micelas invertidas foi estudado avaliando a reacção de transamidação para síntese de ácido acetohidroxâmico, catalisada pela amidase expressa por ambas as estirpes. No sistema de micelas invertidas fez-se variar conteúdo de água (w0) e foi estudado o efeito na actividade enzimática e no rendimento de síntese de acetohidroxamato. Os resultados demonstraram um aumento considerável de actividade específica e do rendimento de síntese no sistema de micelas comparativamente ao meio convencional aquoso, sugerindo que a metodologia de encapsulamento do biocatalisador demonstrou potencialidades de utilização na síntese de hidroxamatos, compostos de elevada importância e aplicabilidade. Na variação do conteúdo de água no sistema micelar obteve-se uma curva em sino de actividade específica e de rendimento, com um pico de actividade para w0 = 10, quer em células intactas, extracto celular e amidase purificada de ambas as estirpes. No caso da Pseudomonas aeruginosa L10 alcançaram-se actividades específicas de 8, 11 e 103 UI/mg de proteína e rendimentos de 94, 99 e 40 % respectivamente para células intactas, extracto celular e amidase purificada. Quanto à Pseudomonas aeruginosa AI3 obtiveram-se, respectivamente, actividades específicas de 5, 9 e 163 UI/ mg de proteína e rendimentos de 66, 66 e 28 % para células intactas, extracto celular e amidase purificada. A estabilidade de armazenamento do biocatalisador no sistema de micelas invertidas e em solução aquosa a 24ºC foi avaliada. Este estudo revelou um aumento do t1/2 no sistema de micelas face ao armazenamento em solução aquosa convencional. No caso da Pseudomonas aeruginosa L10 os melhores resultados foram obtidos para a amidase purificada encapsulada revelando um t1/2 de 17 dias. Quanto ao extracto celular da Pseudomonas aeruginosa AI3 demonstrou um t1/2 de 26 dias quando encapsulado no sistema de micelas. O estudo das alterações estruturais na amidase, de ambas as estirpes, devidas ao encapsulamento em micelas invertidas foi realizado recorrendo à espectroscopia de FTIR. Esta análise permitiu verificar que a amidase AI3 não alterou significativamente a sua estrutura secundária em micelas invertidas para diferentes w0. No entanto, no encapsulamento a sua estrutura secundária sofreu alterações face à estrutura do enzima em solução aquosa. A amidase L10 exibe apenas alterações estruturais face à estrutura que exibe em solução aquosa quando confinada em micelas para w0 3,5 e 4.

Construção de um biossensor para o doseamento de ureia baseado na inibição enzimática da amidase de pseudomonas aeruginosa com recurso a um eléctrodo selectivo de iões amónio

Era objectivo do presente trabalho o desenvolvimento de um biossensor baseado na inibição da amidase de Pseudomonas aeruginosa para a quantificação de ureia em diversas amostras com recurso a um eléctrodo selectivo de iões amónio (ISE). A ureia é um poderoso inibidor do centro activo da amidase (Acilamida hidrolase EC 3.5.1.4) de Pseudomonas aeruginosa a qual catalisa a hidrólise de amidas alifáticas produzindo o ácido correspondente e amónia. O extracto celular de Pseudomonas aeruginosa L10 contendo actividade de amidase foi imobilizado em membranas de poliétersulfona modificadas (PES) e em membranas de nylon Porablot NY Plus na presença de gelatina e de glutaraldeído (GA) como agente bifuncional. Estas membranas foram posteriormente utilizadas na construção do biossensor baseado no ISE, utilizando acetamida como substrato, a reacção enzimática foi seguida medindo os iões amónio produzidos pela hidrólise da amida alifática, e a resposta do biossensor apresentada como a velocidade inicial da reacção (mV.min-1). A optimização dos parâmetros de imobilização foi efectuada de acordo com a metodologia ANOVA. Assim, a mistura de 30μL extracto celular, 2μL GA (5%) e 10 μL Gelatina 15% (p/v) foi a que conduziu a uma melhor resposta do biossensor. Efectuou-se ainda o estudo de optimização de alguns parâmetros experimentais pH e tempo de incubação em ureia, este conduziu ao valor pH=7,2 como pH óptimo de resposta do biossensor e 20 min como tempo óptimo de incubação das membranas nas soluções de ureia, sendo neste caso a resposta do biossensor dada pela diferença das respostas do biossensor antes e após incubação. A calibração do biossensor foi efectuada em soluções contendo concentrações conhecidas de ureia preparadas em tampão Tris, leite e vinho caseiro, exibindo um limite de detecção de 2,0 ×10-6 M de ureia. A incubação das membranas em hidroxilamina 2M por um período de 2h permitiu a recuperação de 70% da actividade enzimática da membrana. O biossensor apresentou uma elevada estabilidade de armazenamento por um período de 55 dias revelando uma perda de apenas 15% da sua resposta. O biossensor desenvolvido apresenta uma sensibilidade de 58,245 mV.min-1 e um tempo de resposta de aproximadamente 20s. A resposta do biossensor foi linear para concentrações de ureia presentes no vinho na gama de 4-10 μM de ureia.

Análise da produção de uma amidase recombinante de pseudomonas aeruginosa

O presente trabalho consistiu na optimização da produção da amidase (EC.3.5.1.4 recombinante de Escherichia coli cujo gene foi isolado de Pseudomonas aeruginosa 8602. O efeito na agregação do enzima in vivo de diversos parâmetros de crescimento, tais como concentração de IPTG, temperatura de incubação e 3% de etanol, foi estudado por combinação da actividade enzimática com a espectrocospia de FTIR. Os resultados demosntraram que ocorreu a formação de amidase agregada na forma de corpos de inclusão em todas as condições de crescimento. A actividade enzimática máxima obtida na fracção solúvel ocorreu para a condição de 4,40 mM IPTG com etanol a 37º C enquanto que nas fracções insolúveis a actividade enzimática máxima obtida foi para a condição de 0,70mM IPTG com etanol a 25ºC. Verificou-se ainda que o etanol nas condições de crescimento de 25ºC permitiu uma elevada expressão de amidase, mas que agragou numa forma biologicamente activa apresentando para determinadas condições um aumento de 60% de actividade específica em relação à fracção solúvel. A espectrocospia de FTIR foi utilizada para o estudo de possíveis alterações estruturais da amidase produzida nas diversas condições de crescimento. Constatou-se assim que para todas as condições de crescimento, a amidase agregou na forma de corpos de inclusão devido ao aumento de folhas-β agregadas resultante de um aumento de interacções intermoleculares comparativamente ao enzima purificado. De um modo geral as condições a 25ºC formam maior quantidade de folhas-β agregadas que as condições a 37ºC, principalmente na presença de etanol. Verificou-se ainda que os corpos de inclusão das condições de crescimento de 37ºC apresentam uma estrutura secundária mais semelhante com a solução de amidase purificada relativamente às condições de 25ºC. No entanto as condições de 37ºC apresentam agragados com menor actividade possivelmente devido à ocorrência de interacções intermoleculares associadas a uma estrutura secundária mais semelhante à nativa. A solubilização não desnaturante da amidase nos corpos de inclusão foi efectuada com sucesso na presença de L-Arginina obtendo-se maior rendimento de solubilização para as condições a 37ºC, comprovando a menor quantidade de interacções intermoleculares nestes agregados e uma estrutura secundária do enzima agregado semelhante à nativa.