Detecção e caracterização de patotipos diarreiogênicos de Escherichia coli por métodos fenotípicos e genotípicos em indivíduos de todas as idades atendidos nas unidades de saúde de Vitória-ES

A diarreia é a segunda causa de mortalidade em <5 anos e é responsável pela diminuição da produtividade na população economicamente ativa. Dentre os agentes infecciosos envolvidos, seis patotipos diarreiogênicos de Escherichia coli (DEC) merecem destaque: E. coli enteropatogênica (EPEC), E.coli enteroinvasora (EIEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroemorrágica ou produtora de toxina de Shiga (EHEC/STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli de aderência difusa (DAEC). O objetivo deste estudo foi determinar a frequência dos patotipos de DEC e caracterizar fenotípica e genotipicamente EAEC, DAEC, aEPEC e E. coli chain-like adhesion (CLA) isolados de fezes indivíduos de todas as idades atendidos nas Unidades de Saúde do município de Vitória, ES, entre janeiro de 2008 e junho de 2011. Os isolados de E. coli foram submetidos à: (i) PCR para detecção dos genes eae, bfpA, aat, lt, st, ipaH, stx1 e stx2; (ii) hibridização de colônia com as sondas eae, aat e daaC; (iii) adesão em cultura de células HEp-2 para evidenciar padrão de aderência agregativa (AA), difusa (DA) e chain-like adhesion (CLA). PCR para detecção de genes de virulência foi realizado em isolados de EAEC, CLA, DAEC e aEPEC. Isolados de EAEC e CLA, foram submetidos a testes de formação de biofilme e de película. Foram obtidos 328 espécimes fecais e E. coli foi isolada de 85,7%. Os seguintes patotipos foram identificados: EAEC (18,3%), DAEC (11%), aEPEC (2,6%), ETEC (0,7%). CLA foi identificada em 4,9% e EIEC, tEPEC e STEC não foram detectados. Dos 60 isolados de EAEC (AA) (25% aat+ por PCR e 35% por hibridização), fímbrias de aderência agregativa foram evidenciadas em baixa frequência (aggA- 1,7%, aafA- 0%, agg3A- 11,7%, hdA- 8,3%). EAEC típica correspondeu a 31,7% dos isolados de EAEC (aggR+), e foram significantes nestas a formação de biofilme, escore 3+ de produção de película e presença dos genes aat, agg3A, hdA, aap, sat, pet, set1A e iucA. Todos os isolados CLA apresentaram o gene pet, 87,5%, foram aggR-, formaram película e nenhum produziu biofilme. Dentre dos 42 isolados de DAEC (DA), a sonda daaC detectou 52,4%. PCR evidenciou adesinas afa/Dr (daaD e afa) em 59,5% e adesina AIDA-I não foi encontrada, sugerindo que outras adesinas estejam envolvidas na adesão da DAEC. Isolados de DAEC afa/Dr + foram estatisticamente mais isolados de <5 anos. Em aEPEC, os genes da ilha de patogenicidade OI-122 pesquisados, nleE, efa1/lifA e paa foram evidenciados em 30% dos isolados, todos provenientes de <5 anos. Características de virulência de tEAEC e DAEC Afa/Dr sugerem que sejam subpopulações relacionadas com diarreia. CLA não parece ser variante de EAEC.

Desenvolvimento e avaliação da acurácia do sistema de filtração (BacFil 6.0) na detecção de bacilos álcool-ácido resistentes em amostras de lavado broncoalveolar de pacientes com suspeita de tuberculose

A baciloscopia é o principal método diagnóstico da tuberculose (TB) em razão do seu baixo custo, rapidez e facilidade de execução. Porém sua sensibilidade é baixa, principalmente nas formas paucibacilares da doença. Nesse sentido, novas metodologias que resultem no aumento da sensibilidade da baciloscopia tornam-se absolutamente necessárias. Neste estudo, nos propusemos a aprimorar e padronizar o sistema de filtração BacFil e avaliar sua performance e acurácia em amostras paucibacilares (lavado broncoalveolar). Para alcançar esses objetivos desenvolvemos o estudo em duas fases. Na primeira fase, foram realizados ensaios para definir: 1) utilização de membranas brancas para visualização de BAAR corados por Auramina-O; 2) aumento do volume de NALC, utilização de pérolas de vidro no processo de digestão das amostras e mudança no sistema do suporte do pré-filtro; 3) meios de fixação da membrana de filtração na lâmina de microscopia; 4) limite de detecção da técnica; 5) aumento do volume de NaOCl e a influência desse aumento na visualização de BAAR na membrana. Verificou-se que: a membrana de policarbonato branca tem a mesma eficiência da membrana de policarbonato preta na visualização de BAAR fluorescentes; o método modificado utilizando maior concentração de NALC, pérolas de vidro e sistema de pré-filtro baseado em orifícios obteve 98% de passagem das amostras pelo sistema; a melhor forma de fixação da membrana na lâmina foi obtida por intermédio da utilização de fita dupla face; o limite de detecção da técnica de filtração utilizando o sistema BacFil versão 6.0 foi de 2 a 9 BAAR por mililitro de suspensão bacteriana com D.O de 0,250 ± 0,01 a 625nm; o aumento da concentração de NaOCl para 10% ajuda na passagem de um maior volume de amostra pelo sistema, porém ocasiona a diminuição da quantidade BAAR na membrana de filtração após o período necessário para todo o processo. Na segunda fase foi avaliado acurácia da técnica padronizada em 101 amostras de lavado broncoalveolar (LBA) de pacientes com suspeita de TB provenientes do Hospital Universitário Cassiano Antônio de Moraes. Observou-se que a sensibilidade da técnica de filtração (BacFil versão 6.0) foi de 76% e especificidade de 95%. A sensibilidade obtida foi significativamente maior do que a observada na baciloscopia após centrifugação que foi de 59% (p = 0,001). No entanto, constatou-se uma diminuição de especificidade na técnica de filtração (95%) em relação a técnica de 8 centrifugação (99%). Concluímos que as modificações realizadas nos sistema de filtração permitiu sanar os problemas técnicos apresentados nas versões anteriores e aumentar a sensibilidade da baciloscopia de amostras paucibacilares (lavado broncoalveolar) para o diagnóstico da TB pulmonar.