Synthèse des fragments de l'ionomycine

L’ionomycine est un ionophore produit par la bactérie gram-positive streptomyces conglobatus. Sa synthèse représente un défi, car il possède plusieurs centres chiraux dans un motif polypropylène. De plus, la grande densité d’oxygène sur celui-ci oblige l’utilisation de plusieurs protections orthogonales. Notre stratégie divise l’ionomycine en quatre fragments, trois possédant le motif polypropylène, ainsi qu’un quatrième, bis-tétrahydrofuranne. Les trois premiers sont synthétisés en utilisant une méthodologie puissante développée dans le laboratoire du Pr Spino, qui utilise l’addition d’alkylcyanocuprates sur les carbonates allyliques dérivés de la menthone. Celle-ci permet l’introduction d’une unité propylène, avec un excellent contrôle du centre chiral introduit. Cette méthode est utilisée de manière itérative, afin d’introduire plusieurs unités propylènes. De plus, notre stratégie est hautement convergente, puisque des intermédiaires des fragments plus courts servent de produit de départ pour la synthèse des fragments plus longs. Le dernier fragment, bis-tétrahydrofuranne, a été fabriqué à partir de l’acétate de géranyle, par une polycyclisation d’un diépoxyde chiral, les époxydes ayant été introduits par une époxydation de Shi. Cette synthèse, si complétée, serait la plus courte publiée, avec 24 étapes pour la séquence linéaire la plus longue (51 au total).

Nouvelle souche donneuse pour la conjugaison intergénérique avec les actinobactéries

Les actinomycètes filamenteux du sol appartenant au genre Frankia peuvent vivre librement en tant que saprophytes, ou encore s'associer aux racines de plantes pour former une symbiose. Malgré leur importance écologique et l'intérêt biologique qu'ils suscitent, plusieurs aspects de la biologie des Frankiaceae demeurent mal compris. Ceci est dû, entre autres, à leur faible taux de génération et à la difficulté de maintenir des cultures en croissance active, mais surtout, à l’absence d’outils génétiques fonctionnels et efficaces pour les étudier. En raison de l’importance environnementale de Frankia, la mise au point d’un système de modification génétique chez cette actinobactérie est devenue essentielle pour procéder à l’analyse fonctionnelle des gènes d’intérêt et étudier plus efficacement la physiologie et les interactions de ce symbiote actinorhizien avec ses plantes hôtes. Parmi les différentes méthodes de modification génétique, la conjugaison bactérienne semble un moyen efficace pour permettre l’échange de matériel génétique chez plusieurs actinomycètes. Ainsi, la souche Escherichia coli ET12567, fréquemment utilisée lors des conjugaisons intergénériques avec diverses actinobactéries, dont Streptomyces, Amycolatopsis, Kitasatospora et Micromonospora, semble une bonne candidate pour servir de bactérie donneuse lors des conjugaisons intergénériques. Comme l'utilisation d'une souche donneuse auxotrophe permet de faciliter l'étape de contre-sélection, la mutation dapA, codant pour la synthèse de l'acide diaminopimélique (DAP), sera introduite chez E. coli ET12567/pUZ8002. Étant donné que le DAP est un constituant essentiel de la paroi de peptidoglycane et un précurseur de la lysine, cette souche sera totalement dépendante de l'ajout de DAP exogène dans le milieu de culture. Ainsi, la contre-sélection se fera simplement en cessant l'ajout de DAP, rendant cette étape non seulement plus facile et efficace, mais aussi permettant d'éviter l'utilisation d'antibiotique. La croissance des exconjugants peut ainsi se faire dans des conditions optimales, ce qui est particulièrement intéressant pour les actinomycètes présentant une croissance lente comme c'est le cas pour Frankia. Les résultats obtenus montrent que l'utilisation de l'acide nalidixique est moins efficace que la déplétion en DAP pour contre-sélectionner la souche donneuse après conjugaison. L'utilisation d'un mutant ΔdapA comme alternative à l'utilisation d'antibiotique rend la conjugaison bactérienne accessible à un plus large spectre de microorganismes potentiellement sensibles à l'acide nalidixique. Il est clair que les stratégies de clonage qui seront développées auront un impact significatif sur la recherche fondamentale et appliquée chez les actinomycètes, permettant des analyses fonctionnelles des gènes d’intérêts, que ce soit par interruption ou remplacement de gènes ou encore par complémentation génique.