Élucidation du rôle et du mécanisme d’action de la protéine Cuf2 lors de la méiose chez la levure Schizosaccharomyces pombe

Chez Schizosaccharomyces pombe, le cycle méiotique est le mode de division cellulaire spécialisé qui permet la formation d’ascospores résistantes à différents stress lorsque les conditions environnementales ne sont pas propices à la multiplication cellulaire. Lors de mes travaux de thèse, mes objectifs consistaient à caractériser le rôle et le mécanisme d’action de la protéine Cuf2 lors du cycle méiotique chez S. pombe. Mes résultats ont montré que le gène cuf2[indice supérieur +] était exprimé exclusivement lors des divisions méiotiques et que la protéine se co-localisait de manière constitutive avec le matériel génétique. De plus, mes résultats ont dévoilé que Cuf2 participait à l’activation et à la répression de plusieurs gènes méiotiques selon un mécanisme de nature transcriptionnelle en s’associant spécifiquement avec leur région promotrice. Par la suite, mes résultats ont mis en évidence que Cuf2 interagissait physiquement avec Mei4, un facteur de transcription méiose-spécifique, au noyau des cellules méiotiques. Notamment, mes résultats ont montré que la présence de Mei4 et de son motif de liaison à l’ADN dénommé FLEX étaient nécessaires afin que Cuf2 puisse s’associer au promoteur de son gène cible fzr1[indice supérieur +] afin d’en activer l’expression. L’ensemble de mes résultats indiquent que Cuf2 et Mei4 interagissent aux promoteurs de certains gènes lors des divisions méiotiques afin d’en co-activer l’expression. D’ailleurs, mes résultats ont également montré que la fonction de Cuf2 était importante à la formation d’ascospores et à leur viabilité ; en absence de Cuf2, la majorité des ascospores présentent diverses aberrations et plus de la moitié d’entre elles sont non-viables. Globalement, mes résultats démontrent que Cuf2 est un régulateur critique de l’expression génique lors du cycle méiotique et que cette fonction est essentielle à la sporulation chez S. pombe.

Caractérisation structurale de Miz-1 dans le cadre de la répression génique causée par le complexe c-Myc/Miz-1

Résumé : c-Myc est un facteur de transcription (FT) dont les niveaux cellulaires sont dérégulés dans la majorité des cancers chez l’homme. En hétérodimère avec son partenaire obligatoire Max, c-Myc lie préférentiellement les séquences E-Box (CACGTG) et cause l’expression de gènes impliqués dans la biosynthèse des protéines et des ARNs, dans le métabolisme et dans la prolifération cellulaire. Il est maintenant bien connu que c-Myc exerce aussi son potentiel mitogène en liant et inhibant différents FTs impliqués dans l’expression de gènes cytostatiques. Entre autres, c-Myc est en mesure d’inhiber Miz-1, un FT comportant 13 doigts de zinc de type Cys2-His2 (ZFs) impliqué dans l’expression de plusieurs gènes régulateurs du cycle cellulaire comprenant les inhibiteurs de CDK p15[indice supérieur INK4], p21[indice supérieur CIP1] et p57[indice supérieur KIP2]. Plus récemment, il fut démontré qu’en contrepartie, Miz-1 est aussi en mesure de renverser les fonctions activatrices de c-Myc et de prévenir la prolifération de cellules cancéreuses dépendantes de c-Myc. Ces différentes observations ont mené à la suggestion de l’hypothèse intéressante que la balance des niveaux de Miz-1 et c-Myc pourrait dicter le destin de la cellule et a permis d’établir Miz-1 comme nouvelle cible potentielle pour le développement d’agents anti-cancéreux. Malgré le fait que ces deux protéines semblent centrales à la régulation du cycle cellulaire, les mécanismes moléculaires leur permettant de s’inhiber mutuellement ainsi que les déterminants moléculaires permettant leur association spécifique demeurent assez peu documentés pour le moment. De plus, la biologie structurale de Miz-1 demeure à être explorée puisque qu’aucune structure de ses 13 ZFs, essentiels à sa liaison à l’ADN, n’a été déterminée pour l’instant. Les travaux réalisés dans le cadre cette thèse visent la caractérisation structurale et biophysique de Miz-1 dans le contexte de la répression génique causée par le complexe c-Myc/Miz-1. Nous présentons des résultats d’éxpériences in vitro démontrant que Miz-1 interagit avec c-Myc via un domaine contenu entre ses ZFs 12 et 13. De plus, nous démontrons que Miz-1 et Max sont en compétition pour la liaison de c-Myc. Ces résultats suggèrent pour la permière fois que Miz-1 inhibe les activités de c-Myc en prévenant son interaction avec son partenaire obligatoire Max. De plus, ils laissent présager que que Miz-1 pourrait servir de référence pour le développement d’inhibiteurs peptidiques de c-Myc. Finalement, nous avons réalisé la caractérisation structurale et dynamique des ZFs 1 à 4 et 8 à 10 de Miz-1 et avons évalué leur potentiel de liaison à l’ADN. Les résultats obtenus, couplés à des analyses bio-informatiques, nous permettent de suggérer un modèle détaillé pour la liaison spécifique de Miz-1 à son ADN consensus récemment identifié.

Études de la liaison du complexe Ku aux télomères et du délai de croissance des survivants de type I chez Saccharomyces cerevisiae

L’extrémité des chromosomes linéaires est une structure nucléoprotéique très conservée chez les organismes eucaryotes. Elle est constituée du télomère et des régions sous-télomériques répétées (STR) qui sont placées en amont du télomère. Chez la levure bourgeonnante, on trouve deux types de télomère, les télomères XY’ et les télomères X, qui se distinguent par la nature des STR positionnées en amont des répétitions télomériques. Le télomère et les STR sont liés par pas moins de dix protéines qui vont participer au maintien et à la régulation de l’extrémité chromosomique nécessaires à la stabilité du génome. Le télomère protège ainsi le chromosome de dégradations ou encore de fusions avec d’autres chromosomes. Le maintien de la taille du télomère est assuré par la télomérase, une transcriptase inverse, qui permet l’ajout de répétitions pour pallier leur perte lors de la phase de réplication durant le cycle cellulaire. Lorsque la télomérase est absente, deux types particuliers de cellules, les survivants de type I et les survivants de type II, peuvent maintenir leurs télomères grâce aux mécanismes de recombinaison homologue. Chez l’humain, les répétitions télomériques sont également liées par un certain nombre de protéines nécessaires au maintien de la stabilité de l’extrémité chromosomique. L’implication des télomères dans les processus de cancérisation, de vieillissement, mais également dans des maladies congénitales fait de cette structure un pivot dans le domaine de la recherche fondamentale. Dans 10 % des cas de cancers, l’allongement n’est pas dû à une réactivation de la télomérase comme c’est en général le cas, mais est inhérent à des processus de recombinaison homologue, comme chez la levure. Les homologies de séquences, de protéines, mais aussi de mécanismes de régulation des télomères avec les cellules humaines, font de S. cerevisiae un excellent modèle d’étude. Cette thèse se divise en trois chapitres. Les deux premiers traitent de l’interaction du complexe yKu avec les télomères de type XY’ dans le chapitre 1 puis de son interaction avec les télomères de type X dans le chapitre 2. Le chapitre 3 traite du comportement d’un type de survivant chez S. cerevisiae. Le chapitre 1 porte donc sur l’analyse des sites de liaison aux télomères XY’ du complexe yKu par la technique de ChEC in vivo. yKu intervient dans de nombreux processus de régulation des télomères, mais aussi dans un mécanisme de réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBs), la NHEJ (Non homologous end-joining). Les résultats présentés dans cette partie appuient un modèle dans lequel yKu aurait plusieurs sites de liaison aux télomères et dans les répétitions télomériques interstitielles. Nous supposons que la liaison du complexe se ferait lors de la formation d’une cassure de type « one-sided break » générée à la suite du passage de la fourche de réplication à l’intérieur des répétitions télomériques. Le chapitre 2 est également une étude des sites de liaison par la technique de ChEC in vivo du complexe yKu, mais cette fois-ci aux télomères X. Les observations faites dans cette partie viennent corroborer les résultats du chapitre 1 de la liaison de yKu à la jonction entre le télomère et les STRs, de plus elle met en évidence des interactions potentielles du complexe avec les éléments X laissant supposer l’existence d’un potentiel repliement du télomère sur la région sous-télomérique chez la levure. Enfin, le chapitre 3 est axé sur l’étude du comportement des survivants de type I, des cellules post-sénescences qui maintiennent leurs télomères par un processus de recombinaison homologue, le mécanisme de BIR (break-induced replication) en l’absence de télomérase. Les survivants de type I présentent une croissance lente liée à un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M qui dépend de la protéine de contrôle Rad9, dont l’activité est en général induite par des cassures double-brin. Ce chapitre a permis d’apporter des précisions sur la croissance lente probablement inhérente à un berceau télomérique très restreint chez ce type cellulaire.

Implication de TLE3 et KDM5A dans la régulation de la transcription des gènes cibles du récepteur des œstrogènes ERα

Dans le noyau cellulaire, l’ADN est compacté autour de petites protéines appelées histones formant ainsi le nucléosome, unité de base de la chromatine. Les nucléosomes contrôlent la liaison des facteurs de transcription à l’ADN et sont ainsi responsables de la régulation des processus cellulaires tels que la transcription. Afin de permettre l’expression des gènes, la chromatine est remodelée, c’est-à-dire que les nucléosomes sont repositionnés de manière à ce que la machinerie générale de la transcription puisse atteindre l’ADN afin de produire l’ARN messager. La moindre petite modification dans la fonction des facteurs de transcription ou des enzymes responsables du remodelage de la chromatine entraine des variations d’expression des gènes, et donc des maladies telles que les cancers. Le cancer du sein est le cancer le plus couramment développé chez les femmes. Cette maladie est principalement causée par l’activité du récepteur des œstrogènes ERα et de ses co-régulateurs ayant, pour la plupart, un rôle direct sur le remodelage de la chromatine. Afin de mieux comprendre le développement et la progression du cancer du sein, nous avons décidé d’étudier le rôle de deux co-régulateurs de ERα, TLE3 et KDM5A, impliqués dans le remodelage de la chromatine et dont la fonction dans le cancer du sein est indéterminée. Nous avons démontré que TLE3 est un partenaire d’interaction du facteur pionnier FoxA1, facteur nécessaire à la liaison de ERα sur l’ADN pour la transcription des gènes cibles de ce récepteur. L’interaction de TLE3 avec FoxA1 inhibe la liaison de ERα à l’ADN en absence d’œstrogènes, via le recrutement de HDAC2 qui déacétyle la chromatine, empêchant alors l’activation fortuite de la transcription en absence de signal. Quant à KDM5A, malgré sa réputation de répresseur de la transcription, dans le cancer du sein, cette déméthylase de H3K4me2/3 est un coactivateur de ERα, dû à son rôle direct sur l’expression du récepteur.

Étude du comportement de la chromatine, de la régulation de la transcription et réparation des gènes de l’ARNr avant la réplication de l’ADN et assemblage de la réparation par excision de nucléotides chez Saccharomyces cerevisiae

Résumé : Le nucléole est considéré comme étant une « usine » à produire des ribosomes. Cette production est la fonction la plus énergivore de la cellule. Elle met en jeu les trois ARN polymérases et représente 80% de l’activité de transcription au sein d’une cellule. Les trois quarts de cette activité de transcription correspondent à la synthèse des ARNr par l’ARN polymérase I (ARNPI). Ainsi mieux comprendre les mécanismes cellulaires se déroulant à l’intérieur de ce compartiment permettra le développement de nouveaux traitements contre le cancer. La synthèse d’ARNr par l’ARNPI est régulée à trois niveaux : l’initiation de la transcription, l’élongation et le nombre de gènes de l’ARNr en transcription. La plupart des travaux qui se sont intéressés à ces niveaux de régulation ont été réalisés avec des cellules en phase exponentielle de croissance. Au cours de mes travaux, je me suis attardé sur la régulation de la transcription par l’ARNPI au cours de la phase G1 du cycle cellulaire et au début de la phase S. Ainsi mes résultats ont montré que si la chromatine des gènes de l’ARNr est essentiellement dépourvue de nucléosomes, la régulation de l’ARNPI diffère dans des cellules en G1 et au début de la phase S. J’ai pu de ce fait observer qu’en G1, la transcription de l’ARNPI se concentre sur un nombre réduit de gènes en transcription. Dans des cellules arrêtées au début de la phase S avec de l’hydroxyurée, la transcription de l’ARNPI est perturbée par un défaut de maturation de l’ARNR. Fort de ces résultats sur la nature des gènes ribosomaux en phase G1, je me suis attardé à la réparation de ces gènes lors de cette phase. Alors que dans des cellules en phase exponentielle de croissance irradiées avec des UVC, la chromatine des gènes de l’ARNr se ferme ; je n’ai pas observé la formation de nucléosomes suite à l’irradiation de cellules synchronisée en G1. Mes résultats montrent également que la réparation est plus efficace. Parallèlement, j’ai exploré l’assemblage du complexe de réparation par excision de nucléotides. Toutefois, les résultats obtenus sont peu concluants.

Implication des protéines MCM dans la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN

Les protéines MCM (minichromosome maintenance) forment un complexe hétérohexamérique composé des protéines MCM2 à MCM7 qui possède une activité hélicase nécessaire lors de la réplication de l’ADN. Ce complexe est la cible des protéines ATM et ATR, kinases responsables de l’initiation de la réponse cellulaires aux dommages à l’ADN, pour permettre l’arrêt de la réplication lors de la détection de cassure double brin. De plus, les MCM permettent le remodelage de la chromatine par leur activité hélicase mais aussi par leur association avec une chaperone d’histone la protéine ASF1. Toutefois, la majorité des complexes MCM ne co-localisent pas avec les origines de réplication. De plus, la quantité des protéines MCM dans la cellule est nettement supérieure à la quantité requise lors de la réplication. Ces deux faits laissent présager que ce complexe hélicase pourrait jouer un second rôle. Des études effectuées au laboratoire ont démontré une augmentation de la fixation à la chromatine des protéines MCM suite au traitement avec l’étoposide, un inhibiteur de la topoisomérase II qui cause des cassures double brin. L’étude des interactions de la protéine MCM2 par spectrométrie de masse ainsi que par immunobuvardage ont démontré une augmentation de l’interaction entre la protéine MCM2 et ASF1 suite aux dommages. Ceci suggère que les protéines MCM pourraient être impliquées dans les mécanismes de réparation de l’ADN. La nature de l’interaction entre la protéine MCM2 et ASF1 a été déterminée in vitro par des immunobuvardages de type Far western et des Dot blot avec des mutants de la protéine MCM2. Des cellules U2OS-Flp-in ont été utilisées pour générer des lignées stables exprimants les protéines MCM2 à MCM7 avec une étiquette GFP ou fusionnées avec une biotine-ligase (BirA). Les cellules ont été cultivées dans du milieu SILAC et des immunoprécipitations ont été effectuées sur des cellules contrôles (R0K0), des cellules qui expriment MCM-GFP ou BirA (R6K4) non-traitées et des cellules qui expriment MCM-GFP ou BirA traitées à l’étoposide (R10K8). Les immunoprécipitations ont été analysés au spectromètre de masse pour déterminer la modulation des interactions avant et après dommages à l’ADN. Les études d’interactions in vitro ont permis d’identifier que l’interaction entre la protéine MCM2 et ASF1 se situe entre les acides aminés 81-162 sur la protéine MCM2. L’approche de spectrométrie de masse a permis d’identifier plusieurs protéines liant le complexe MCM qui sont impliquées non seulement dans la réplication de l’ADN mais aussi dans le remodelage de la chromatine. De plus, certains de ces nouveaux partenaires augmentent leur interaction avec le complexe suite à l’induction de dommages. Ces résultats suggèrent que les protéines MCM jouent un rôle dans la réorganisation de la chromatine dans les mécanismes de réparation de l’ADN.

Cartographie des cassures bicaténaires du remodelage chromatinien du spermatide et développement des outils techniques associés.

Résumé : La phase haploïde de la spermatogenèse (spermiogenèse) est caractérisée par une modification importante de la structure de la chromatine et un changement de la topologie de l’ADN du spermatide. Les mécanismes par lesquels ce changement se produit ainsi que les protéines impliquées ne sont pas encore complètement élucidés. Mes travaux ont permis d’établir la présence de cassures bicaténaires transitoires pendant ce remodelage par l’essai des comètes et l’électrophorèse en champ pulsé. En procédant à des immunofluorescences sur coupes de tissus et en utilisant un extrait nucléaire hautement actif, la présence de topoisomérases ainsi que de marqueurs de systèmes de réparation a été confirmée. Les protéines de réparation identifiées font partie de systèmes sujets à l’erreur, donc cette refonte structurale de la chromatine pourrait être génétiquement instable et expliquer le biais paternel observé pour les mutations de novo dans de récentes études impliquant des criblages à haut débit. Une technique permettant l’immunocapture spécifique des cassures bicaténaires a été développée et appliquée sur des spermatides murins représentant différentes étapes de différenciation. Les résultats de séquençage à haut débit ont montré que les cassures bicaténaires (hotspots) de la spermiogenèse se produisent en majorité dans l’ADN intergénique, notamment dans les séquences LINE1, l’ADN satellite et les répétions simples. Les hotspots contiennent aussi des motifs de liaisons des protéines des familles FOX et PRDM, dont les fonctions sont entre autres de lier et remodeler localement la chromatine condensée. Aussi, le motif de liaison de la protéine BRCA1 se trouve enrichi dans les hotspots de cassures bicaténaires. Celle-ci agit entre autres dans la réparation de l’ADN par jonction terminale non-homologue (NHEJ) et dans la réparation des adduits ADN-topoisomérase. De façon remarquable, le motif de reconnaissance de la protéine SPO11, impliquée dans la formation des cassures méiotiques, a été enrichi dans les hotspots, ce qui suggère que la machinerie méiotique serait aussi utilisée pendant la spermiogenèse pour la formation des cassures. Enfin, bien que les hotspots se localisent plutôt dans les séquences intergéniques, les gènes ciblés sont impliqués dans le développement du cerveau et des neurones. Ces résultats sont en accord avec l’origine majoritairement paternelle observée des mutations de novo associées aux troubles du spectre de l’autisme et de la schizophrénie et leur augmentation avec l’âge du père. Puisque les processus du remodelage de la chromatine des spermatides sont conservés dans l’évolution, ces résultats suggèrent que le remodelage de la chromatine de la spermiogenèse représente un mécanisme additionnel contribuant à la formation de mutations de novo, expliquant le biais paternel observé pour certains types de mutations.

Étude de l'influence du variant d'histone H2A.Z sur l'organisation des nucléosomes aux enhancers liés par le récepteur alpha de l'oestrogène

L'identité et la réactivité cellulaires sont établies, maintenues et modulées grâce à l'orchestration de programmes transcriptionnels spécifiques. Les éléments régulateurs, des régions particulières de la chromatine responsables de l'activation ou de la répression des gènes, sont au coeur de cette opération. Ces dernières années, de nombreuses études ont révélé le rôle central des « enhancers » dans ce processus. En effet, des centaines de milliers « enhancers » seraient éparpillés dans le génome humain, majoritairement dans sa portion non-codante, et contrairement au promoteur, leur activation varierait selon le type ou l'état cellulaire ou en réponse à une stimulation physiologique, pathologique ou environnementale. Les « enhancers » sont, en quelque sorte, des carrefours où transitent une multitude de protéines régulées par les signaux intra- et extra-cellulaires et un dialogue s'établit entre ces diverses protéines et la chromatine. L'identification des « enhancers ainsi qu'une compréhension de leur mode de fonctionnement sont donc cruciales, tant au plan fondamental que clinique. La chromatine joue un rôle indéniable dans l'activité des éléments régulateurs, tant par sa composition que par sa structure, en régulant, entre autres, l'accessibilité de l'ADN. En effet, l'ADN des régions régulatrices est bien souvent masqué par un nucléosome occlusif, lequel doit être déplacé ou évincé afin de permettre la liaison des protéines régulatrices, notamment les facteurs de transcription (FTs). Toutefois, la contribution de la composition de la chromatine à ce processus reste incomprise. Le variant d'histone H2A.Z a été identifié comme une composante de la chromatine aux régions accessibles, dont des « enhancers » potentiels. Toutefois son rôle y est inconnu, bien que des études récentes suggèrent qu'il pourrait jouer un rôle important dans la structure de la chromatine à ces régions. Par ailleurs, un lien étroit existe entre H2A.Z et la voie de signalisation des oestrogènes (notamment la 17-[beta]-estradiol (E2)). Ainsi, H2A.Z est essentiel à l'expression de plusieurs gènes cibles de l'E2. Les effets de l'E2 sont en partie exercés par un FT, le récepteur alpha des oestrogènes (ER[alpha]), lequel se lie à l'ADN suite à son activation, et ce majoritairement à des « enhancers », et permet l'établissement d'un programme transcriptionnel spécifique. Cette thèse vise à définir le rôle d'H2A.Z aux « enhancers », et plus particulièrement son influence sur l'organisation des nucléosomes aux « enhancers » liés par ER[alpha]. D'abord, mes travaux effectués à l'échelle du génome ont démontré qu'H2A.Z n'est présent qu'à certains ER[alpha]-« enhancers » actifs. Cette particularité a fait en sorte que nous avons pu comparer directement les « enhancers » actifs occupés par H2A.Z à ceux non-occupés, afin de mettre en évidence sa relation à l'environnement chromatinien. Étonnamment, il est apparu qu'H2A.Z n'introduit pas une organisation unique ou particulière des nucléosomes aux « enhancers ». Par ailleurs, nos résultats montrent qu'H2A.Z joue un rôle crucial dans la régulation de l'activité des « enhancers ». En effet, nous avons observé que suite à leur activation par l'E2, les « enhancers » occupés par H2A.Z recrutent l'ARN polymérase II (ARNPII) et produisent un transcrit. Ils recrutent également RAD21, une composante du complexe cohésine impliqué, entre autres, dans des interactions chromosomiques entre « enhancers » et promoteurs. De façon intéressante, nous avons mis en évidence que ces trois évènements, connus pour leur importance dans l'activité des « enhancers », sont dépendants d'H2A.Z. Ainsi, la présence d'H2A.Z à l' « enhancer » pourrait permettre un environnement chromatinien favorable à trois aspects clés de l'activité des « enhancers » : la présence de l'ARNPII, la transcription et la formation d'une boucle d'interaction, et par la suite, de par la proximité « enhancer »-promoteur ainsi créée, augmenter la concentration d'ARNPII à proximité du promoteur favorisant l'expression du gène cible. Un tel rôle central d'H2A.Z dans l'activité d' « enhancers » spécifiques pourrait participer à un mécanisme épigénétique ciblé de la régulation de l'expression des gènes.

Caractérisation du repliement en temps réel du riborégulateur adénine

Vers la fin des années 1990 et au début des années 2000, l’idée que l’ARN puisse interagir directement avec de petits métabolites pour contrôler l’expression de certains gènes devient de plus en plus acceptée. Des recherches menées à cette époque ont permis la découverte de plusieurs structures d’ARN hautement conservées nommées riborégulateurs. La structure de ces ARN leur permet de reconnaître spécifiquement un ligand. La reconnaissance du ligand entraîne ensuite un changement de conformation dans l’ARN responsable du contrôle de l’expression génétique. Le but de cette thèse est d’étudier la structure et les changements de conformation du riborégulateur associé au gène add liant l’adénine chez Vibrio vulnificus. Ce riborégulateur étant relativement simple, les informations recueillies lors de cette étude pourront servir à comprendre le fonctionnement de riborégulateurs plus complexes. Dans l’introduction, la découverte des riborégulateurs sera décrite en plus des caractéristiques particulières et de l’importance de ces ARN. Par la suite, quelques exemples démontrant l’importance des structures d’ARN seront abordés. Ensuite, les techniques de fluorescence utilisées pour étudier les structures d’ARN au cours de cette thèse seront présentées. Enfin, les recherches effectuées sur les riborégulateurs adénine seront détaillées afin d’aider le lecteur à bien comprendre le type de riborégulateur au centre de cette thèse. Le chapitre 1 traite du repliement de l’aptamère suite à la liaison avec l’adénine. Dans ce chapitre, il est démontré que l’aptamère peut adopter trois conformations. Une modification de la séquence de l’aptamère de type sauvage a permis d’isoler ces trois conformations. Il a ensuite été possible d’identifier les caractéristiques propres à chacun des états. Le chapitre 2 s’intéresse à une région précise du riborégulateur adénine. Dans ce chapitre, la conformation du cœur de l’aptamère est étudiée plus en profondeur. Il y est possible de constater que le repliement du cœur de l’aptamère influence l’interaction boucle-boucle en présence de magnésium et de ligand. De plus, la présence de ligand, en concentration suffisante, permet le repliement du cœur et favorise le rapprochement des tiges P2 et P3 dans un aptamère muté pour empêcher la formation de l’interaction boucle-boucle. Il semble donc que le repliement du cœur de l’aptamère influence la structure globale de l’aptamère. Finalement, les travaux présentés dans les chapitres 1 et 2 seront mis en contexte avec la littérature scientifique disponible. Cette discussion tentera de réconcilier certaines observations contradictoires. Il sera ensuite question de l’impact que les travaux présentés dans cette thèse peuvent avoir dans le domaine de l’ARN. Enfin, quelques études à réaliser en continuité avec ces travaux seront proposées.

DNA damage induced by low energy electrons (LEEs)

Abstract : The major objective of our study is to investigate DNA damage induced by soft X-rays (1.5 keV) and low-energy electrons (˂ 30 eV) using a novel irradiation system created by Prof. Sanche’s group. Thin films of double-stranded DNA are deposited on either glass and tantalum substrates and irradiated under standard temperature and pressure surrounded by a N[subscript 2] environment. Base release (cytosine, thymine, adenine and guanine) and base modifications (8-oxo-7,8-dihydro -2’-deoxyguanosine, 5-hydroxymethyl-2’-deoxyuridine, 5-formyl-2’-deoxyuridine, 5,6-dihydrothymidine and 5,6-dihydro-2’-deoxy uridine) are analyzed and quantified by LC-MS/MS. Our results reveal larger damage yields in the sample deposited on tantalum than those on glass. This can be explained by an enhancement of damage due to low-energy electrons, which are emitted from the metal substrate. From a comparison of the yield of products, base release is the major type of damage especially for purine bases, which are 3-fold greater than base modifications. A proposed pathway leading to base release involves the formation of a transient negative ion (TNI) followed by dissociative electron attachment (DEA) at the N-g lycosidic bond. On the other hand, base modification products consist of two major types of chemical modifications, which include thymine methyl oxidation products that likely arises from DEA from the methyl group of thymine, and 5,6-dihydropyrimidine that can involve the initial addition of electrons, H atoms, or hydride ions to the 5,6-pyrimidine double bond.

Développement et applications d’un outil bio-informatique pour la détection de similarités de champs d’interaction moléculaire

Résumé : Les méthodes de détection de similarités de sites de liaison servent entre autres à la prédiction de fonction et à la prédiction de cibles croisées. Ces méthodes peuvent aider à prévenir les effets secondaires, suggérer le repositionnement de médicament existants, identifier des cibles polypharmacologiques et des remplacements bio-isostériques. La plupart des méthodes utilisent des représentations basées sur les atomes, même si les champs d’interaction moléculaire (MIFs) représentent plus directement ce qui cherche à être identifié. Nous avons développé une méthode bio-informatique, IsoMif, qui détecte les similarités de MIF entre différents sites de liaisons et qui ne nécessite aucun alignement de séquence ou de structure. Sa performance a été comparée à d’autres méthodes avec des bancs d’essais, ce qui n’a jamais été fait pour une méthode basée sur les MIFs. IsoMif performe mieux en moyenne et est plus robuste. Nous avons noté des limites intrinsèques à la méthodologie et d’autres qui proviennent de la nature. L’impact de choix de conception sur la performance est discuté. Nous avons développé une interface en ligne qui permet la détection de similarités entre une protéine et différents ensembles de MIFs précalculés ou à des MIFs choisis par l’utilisateur. Des sessions PyMOL peuvent être téléchargées afin de visualiser les similarités identifiées pour différentes interactions intermoléculaires. Nous avons appliqué IsoMif pour identifier des cibles croisées potentielles de drogues lors d’une analyse à large échelle (5,6 millions de comparaisons). Des simulations d’arrimage moléculaire ont également été effectuées pour les prédictions significatives. L’objectif est de générer des hypothèses de repositionnement et de mécanismes d’effets secondaires observés. Plusieurs exemples sont présentés à cet égard.

Effet des pesticides MCPA et imidaclopride sur la régulation des voies de signalisation du récepteur à la dioxine (AhR) et au récepteur aux androgènes (AR)

Avec l’ère industrielle sont venus les polluants environnementaux. Ils sont de plus en plus pointés du doigt pour une variété d’effets indésirables en particulier pour leur potentiel à affecter la santé humaine. Les pesticides font partie de ces polluants et leurs usages ne font que croître depuis une vingtaine d’années. Ces produits qui servent à améliorer la production agricole en éliminant les pestes qui ravagent les récoltes sont souvent peu étudiés à long terme avant d’être homologués. L’effet perturbateur au niveau cellulaire et les effets à long terme de ces pesticides sont peu connus. Pour ce projet de maîtrise, nous avons observé l’effet de deux pesticides, l’imidaclopride et l’acide 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic (MCPA), sur les voies de signalisation du récepteur à la dioxine (AhR) et du récepteur aux androgènes (AR). L’imidaclopride est un insecticide de la famille des néonicotinoïdes, une classe de plus en plus utilisée. Ce pesticide est surtout connu pour être en lien avec le déclin des colonies d’abeilles depuis une décennie. Le MCPA est un des herbicides les plus utilisés au Québec, il est persistant et souvent retrouvé dans les eaux de la province. Nous avons traité des cellules du cancer du sein et des cellules du cancer de la prostate avec ces pesticides et nous avons vérifié si leur présence perturbait les deux voies de signalisation cellulaire à l’étude. Le récepteur AhR est un facteur de transcription activé par un ligand. Le TCDD, une dioxine, est le meilleur ligand exogène connu à ce jour de ce récepteur. Par contre, ses ligands naturels, des dérivés du tryptophane ou des facteurs de virulence de bactéries, l’activent de façon beaucoup moins forte. Lors de l’activation de la voie AhR, les gènes CYP1A1 et CYP1B1 sont transcrits et codent pour des enzymes du cytochrome P450 qui transforment les ligands en produits plus facilement éliminables. Dans un contexte où de l’œstradiol (E2) est présent dans les cellules, il y a une interaction croisée entre le récepteur à l’œstrogène (ER) et le récepteur AhR, qui fait en sorte que l’expression de CYP1A1 est réprimée. Cela se traduit en un ratio d’enzyme CYP1A1 à CYP1B1 différent qui pourrait augmenter la possibilité d’une accumulation de métabolites génotoxiques. En effet, CYP1B1 hydroxyle le ligand d’AhR mais aussi l’œstradiol en 4-hydroxyœstradiol (4-OHE), dont l’accumulation peut amener des mutations dans l’ADN alors que l’enzyme CYP1A1 l’hydroxyle en 2-hydroxyœstradiol (2-OHE), qui n’as aucun effet néfaste répertorié sur la cellule. Dans les cellules du cancer du sein, le MCPA appliqué en champs induisait fortement l’expression de CYP1B1 comparable à l’échantillon traité au témoin positif (TCDD), alors que CYP1A1 l’était que très légèrement par rapport au témoin non-traité. Au niveau protéique, CYP1A1 n’était qu’exprimée dans le témoin positif (TCDD) et ce, en quantité moindre lorsqu’il y avait présence d’œstradiol. CYP1B1 était fortement exprimée dans l’échantillon de TCDD, ce qui était attendu, mais aussi dans tous les échantillons traités au MCPA de NuFarm. Ces effets ne sont pas notés avec l’ingrédient actif du MCPA. La présence d’un ou plusieurs autres produits ajoutés dans le MCPA de la compagnie NuFarm en combinaison avec l’ingrédient actif pourrait activer la voie de signalisation d’AhR et causer ce débalancement dans l’expression des gènes CYP1A1 et CYP1B1. Nos résultats indiquent que plusieurs concentrations de l’ingrédient actif de l’imidaclopride ne perturbe pas les voies cellulaires d’AhR ni AR, alors que, le MCPA perturbe ces deux voies cellulaires. Par contre, c’est seulement celui produit par la compagnie NuFarm qui est utilisé en champs. Cette formulation appliquée en terrain agricole inclut l’ingrédient actif ainsi que les antigels, les surfactants et les adjuvants qui permettent au produit d’être plus efficace. L’ingrédient actif du MCPA seul n’affectait pas les deux voies. Le récepteur aux androgènes (AR) est aussi un facteur de transcription qui se lie à l’ADN afin de réguler l’expression des gènes et il est particulièrement important pour le développement et le maintien du phénotype masculin. Depuis une vingtaine d’années, des problèmes de baisse de libido et de fertilité s’accentuent dans notre société et semblent être reliés à la baisse de testostérone des hommes (Travison et al. 2007). Cette molécule est d’ailleurs un des deux ligands du récepteur AR, le deuxième étant la 5-dihydrotestostérone (DHT). Le facteur environnemental plutôt que le mode de vie semble être un facteur déterminant dans l’étude qui portait sur ce déclin. Les pesticides ont déjà été soupçonnés pour avoir un potentiel anti-androgénique, mais aucune étude ne fait un lien de causalité direct. Dans le projet de maitrise présenté dans ce document, l’expression des gènes marqueurs PSA (antigène spécifique de la prostate) et PCA3 (antigène du cancer de la prostate) a été quantifiée pour savoir si les pesticides ont un effet perturbateur sur la voie du récepteur AR. Dans les cellules du cancer de la prostate, l’expression de PSA et PCA3 était semblable au non-traité dans l’échantillon traité au MCPA (NuFarm), et ce, même après l’ajout de DHT, qui active l’expression de ces deux gènes. Cette fois-ci, l’ingrédient actif seul faisait en sorte que les deux gènes marqueurs étaient moins exprimés lors de l’ajout de la DHT, par rapport au témoin. Il semblerait que l’ingrédient actif est à la base de ce changement d’expression de nos gènes marqueurs. Donc, le MCPA pourrait avoir un effet anti-androgénique dans les cellules du cancer de la prostate. Donc, le MCPA est un pesticide qui affecte les voies de signalisation cellulaires AhR et AR. Il est particulier de noter que le pesticide appliqué en champ perturbe nettement plus les voies cellulaires. Il sera important de continuer à étudier les effets des pesticides sur l’homme au niveau cellulaire et de comprendre comment ils pourraient contribuer au développement du cancer.

On precise three-dimensional environment modeling via UAV-based photogrammetric systems

Abstract : Images acquired from unmanned aerial vehicles (UAVs) can provide data with unprecedented spatial and temporal resolution for three-dimensional (3D) modeling. Solutions developed for this purpose are mainly operating based on photogrammetry concepts, namely UAV-Photogrammetry Systems (UAV-PS). Such systems are used in applications where both geospatial and visual information of the environment is required. These applications include, but are not limited to, natural resource management such as precision agriculture, military and police-related services such as traffic-law enforcement, precision engineering such as infrastructure inspection, and health services such as epidemic emergency management. UAV-photogrammetry systems can be differentiated based on their spatial characteristics in terms of accuracy and resolution. That is some applications, such as precision engineering, require high-resolution and high-accuracy information of the environment (e.g. 3D modeling with less than one centimeter accuracy and resolution). In other applications, lower levels of accuracy might be sufficient, (e.g. wildlife management needing few decimeters of resolution). However, even in those applications, the specific characteristics of UAV-PSs should be well considered in the steps of both system development and application in order to yield satisfying results. In this regard, this thesis presents a comprehensive review of the applications of unmanned aerial imagery, where the objective was to determine the challenges that remote-sensing applications of UAV systems currently face. This review also allowed recognizing the specific characteristics and requirements of UAV-PSs, which are mostly ignored or not thoroughly assessed in recent studies. Accordingly, the focus of the first part of this thesis is on exploring the methodological and experimental aspects of implementing a UAV-PS. The developed system was extensively evaluated for precise modeling of an open-pit gravel mine and performing volumetric-change measurements. This application was selected for two main reasons. Firstly, this case study provided a challenging environment for 3D modeling, in terms of scale changes, terrain relief variations as well as structure and texture diversities. Secondly, open-pit-mine monitoring demands high levels of accuracy, which justifies our efforts to improve the developed UAV-PS to its maximum capacities. The hardware of the system consisted of an electric-powered helicopter, a high-resolution digital camera, and an inertial navigation system. The software of the system included the in-house programs specifically designed for camera calibration, platform calibration, system integration, onboard data acquisition, flight planning and ground control point (GCP) detection. The detailed features of the system are discussed in the thesis, and solutions are proposed in order to enhance the system and its photogrammetric outputs. The accuracy of the results was evaluated under various mapping conditions, including direct georeferencing and indirect georeferencing with different numbers, distributions and types of ground control points. Additionally, the effects of imaging configuration and network stability on modeling accuracy were assessed. The second part of this thesis concentrates on improving the techniques of sparse and dense reconstruction. The proposed solutions are alternatives to traditional aerial photogrammetry techniques, properly adapted to specific characteristics of unmanned, low-altitude imagery. Firstly, a method was developed for robust sparse matching and epipolar-geometry estimation. The main achievement of this method was its capacity to handle a very high percentage of outliers (errors among corresponding points) with remarkable computational efficiency (compared to the state-of-the-art techniques). Secondly, a block bundle adjustment (BBA) strategy was proposed based on the integration of intrinsic camera calibration parameters as pseudo-observations to Gauss-Helmert model. The principal advantage of this strategy was controlling the adverse effect of unstable imaging networks and noisy image observations on the accuracy of self-calibration. The sparse implementation of this strategy was also performed, which allowed its application to data sets containing a lot of tie points. Finally, the concepts of intrinsic curves were revisited for dense stereo matching. The proposed technique could achieve a high level of accuracy and efficiency by searching only through a small fraction of the whole disparity search space as well as internally handling occlusions and matching ambiguities. These photogrammetric solutions were extensively tested using synthetic data, close-range images and the images acquired from the gravel-pit mine. Achieving absolute 3D mapping accuracy of 11±7 mm illustrated the success of this system for high-precision modeling of the environment.

Mesure de sections efficaces absolues vibrationnelles pour la collision d’électrons de basse énergie (1-19 eV) avec le tétrahydrofurane (THF) condensé

Résumé: Ce mémoire de maîtrise est une étude des probabilités d’interactions (sections efficaces) des électrons de basse énergie avec une molécule d’intérêt biologique. Cette molécule est le tétrahydrofurane (THF) qui est un bon modèle de la molécule constituant la colonne vertébrale de l’ADN; le désoxyribose. Étant donné la grande quantité d’électrons secondaires libérés lors du passage des radiations à travers la matière biologique et sachant que ceux-ci déposent la majorité de l’énergie, l’étude de leurs interactions avec les molécules constituant l’ADN devient rapidement d’une grande importance. Les mesures de sections efficaces sont faites à l’aide d’un spectromètre à haute résolution de pertes d’énergie de l’électron. Les spectres de pertes d’énergie de l’électron obtenus de cet appareil permettent de calculer les valeurs de sections efficaces pour chaque vibration en fonction de l’énergie incidente de l’électron. L’article présenté dans ce mémoire traite de ces mesures et des résultats. En effet, il présente et explique en détail les conditions expérimentales, il décrit la méthode de déconvolution qui est utilisée pour obtenir les valeurs de sections efficaces et il présente et discute des 4 résonances observées dans la dépendance en énergie des sections efficaces. En effet, cette étude a permis de localiser en énergie 4 résonances et celles-ci ont toutes été confirmées par des recherches expérimentales et théoriques antérieures sur le sujet des collisions électrons lents-THF. En outre, jamais ces résonances n’avaient été observées simultanément dans une même étude et jamais la résonance trouvée à basse énergie n’avait été observée avec autant d’intensité que cette présente étude. Cette étude a donc permis de raffiner notre compréhension fondamentale des processus résonants impliqués lors de collisions d’électrons secondaires avec le THF. Les valeurs de sections efficaces sont, quant à elles, très prisées par les théoriciens et sont nécessaires pour les simulations Monte Carlo pour prédire, par exemple, le nombre d’ions formées après le passage des radiations. Ces valeurs pourront justement être utilisées dans les modèles de distribution et dépôt d’énergie au niveau nanoscopique dans les milieux biologiques et ceux-ci pourront éventuellement améliorer l’efficacité des modalités radiothérapeutiques.

La satisfaction des étudiants envers différentes formes de participation de parents volontaires dans une classe de 3e année primaire

L'éducation des enfants prend une large part des préoccupations de notre société québécoise. Assumée presqu'entièrement par les parents jusqu'à l’entrée de l'enfant à l’école, il existe, par la suite, des controverses au sujet du partage de sa responsabilité. Les parents demeurent les premiers éducateurs de l'enfant mais le cadre scolaire offre d'autres possibilités pour compléter sa formation. Jusqu'où les parents peuvent-ils pénétrer le milieu scolaire? et, où s'arrêtent les droits des professionnels de l'école? La discussion est toujours ouverte et depuis longtemps. La participation des parents, dans les politiques éducatives de l'état, comporte un débat actuellement en force. Les recherches dans ce domaine sont relativement récentes. Comme le note Sara L. Lightfoot (1978), les sociologues se sont attardés à l'étude de l’organisation, de la formation des systèmes sociaux et très peu aux relations de l'un à l'autre système. En éducation, ajoute-t-elle, quand des auteurs se penchent sur la liaison entre la famille et l’école, ils ont tendance à se concentrer sur les dissonances et les problèmes qui se dégagent de leurs relations. C'est ce que nous avons constaté lors de notre revue de littérature et plusieurs des recherches citées sont de cet ordre. Mais, d'autres chercheurs axent leurs recherches sur une tangente positive; la participation des parents devient un apport possible au développement académique et social de l'enfant. Ils étudient ce problème sous plusieurs aspects et, malgré certaines prises de positions distinctes les unes des autres tous affirment qu'il est profitable et même nécessaire à l’enfant que ses parents s'intéressent à son vécu scolaire. [...]