Hepsine et matriptase activent l’hémagglutinine des virus influenza A et B et leur inhibition représente une nouvelle stratégie thérapeutique n’entraînant pas le développement de résistance

Résumé: Chaque année, les épidémies saisonnières d’influenza causent de 3 à 5 millions de cas sévères de maladie, entraînant entre 250 000 et 500 000 décès mondialement. Seulement deux classes d’antiviraux sont actuellement commercialisées pour traiter cette infection respiratoire : les inhibiteurs de la neuraminidase, tels que l’oseltamivir (Tamiflu) et les inhibiteurs du canal ionique M2 (adamantanes). Toutefois, leur utilisation est limitée par l’apparition rapide de résistance virale. Il est donc d’un grand intérêt de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’influenza. Le virus influenza dépend de l’activation de sa protéine de surface hémagglutinine (HA) pour être infectieux. L’activation a lieu par clivage protéolytique au sein d’une séquence d’acides aminés conservée. Ce clivage doit être effectué par une enzyme de l’hôte, étant donné que le génome du virus ne code pour aucune protéase. Pour les virus infectant l’humain, plusieurs études ont montré le potentiel de protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP) à promouvoir la réplication virale : TMPRSS2, TMPRSS4, HAT, MSPL, Desc1 et matriptase, identifiée récemment par notre équipe (Beaulieu, Gravel et al., 2013), activent l’HA des virus influenza A (principalement H1N1 et H3N2). Toutefois, il existe peu d’information sur le clivage de l’HA des virus influenza B, et seulement TMPRSS2 et HAT ont été identifiées comme étant capables d’activer ce type de virus. Les travaux de ce projet de maîtrise visaient à identifier d’autres TTSP pouvant activer l’HA de l’influenza B. L’efficacité de clivage par la matriptase, hepsine, HAT et Desc1 a été étudiée et comparée entre ces TTSP. Ces quatre protéases s’avèrent capables de cliver l’HA de l’influenza B in vitro. Cependant, seul le clivage par matriptase, hepsine et HAT promeut la réplication virale. De plus, ces TTSP peuvent aussi supporter la réplication de virus influenza A. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de TTSP, développé en collaboration avec notre laboratoire, permet de bloquer significativement la réplication virale dans les cellules épithéliales bronchiques humaines Calu-3. Cet inhibiteur se lie de façon covalente et lentement réversible au site actif de la TTSP par un mécanisme slow tight-binding. Puisque cet inhibiteur cible une composante de la cellule hôte, et non une protéine virale, il n’entraîne pas le développement de résistance après 15 passages des virus en présence de l’inhibiteur dans les cellules Calu-3. L’inhibition des TTSP activatrices d’HA dans le système respiratoire humain représente donc une nouvelle stratégie thérapeutique pouvant mener au développement d’antiviraux efficaces contre l’influenza.

L’implication de SHP-1 en condition élevée de glucose inhibe la signalisation de l’insuline et du PDGF-BB dans les cellules musculaires lisses vasculaires hypoxiques

Résumé : Bien que l’hypoxie soit un puissant inducteur de l’angiogenèse, l’activation des facteurs de croissance est perturbée en hyperglycémie au niveau du pied et du cœur. Cette perturbation entraîne la perte de prolifération et de migration chez les cellules endothéliales, musculaires lisses vasculaires et péricytes empêchant la formation de nouveaux vaisseaux qui mènera à l’amputation des membres inférieurs chez les patients diabétiques. Une étude a démontré qu’une augmentation de la protéine tyrosine phosphatase Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1) en condition hyperglycémique chez les péricytes entraînait l’inhibition de la signalisation du PDGF-BB, ce qui résultait en le développement d’une rétinopathie diabétique. Nous avons alors soulevé l’hypothèse que l’expression de SHP-1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires affecte la prolifération et la migration cellulaire par l’inhibition de la signalisation de l’insuline et du PDGF-BB en condition diabétique. Nos expérimentations ont été effectuées principalement à l’aide d’une culture primaire de cellules musculaires lisses primaires provenant d’aortes bovines. Comparativement aux concentrations normales de glucose (NG : 5,6 mM), l’exposition à des concentrations élevées de glucose (HG : 25 mM) pendant 48 h a résulté en l’inhibition de la prolifération cellulaire par l’insuline et le PDGF-BB autant en normoxie (20% O2) qu’en hypoxie (24 dernières heures à 1% O2). Lors des essais de migration cellulaire, aucun effet de l’insuline n’a été observé alors que la migration par le PDGF-BB fut inhibée en HG autant en normoxie qu’en hypoxie. L’exposition en HG à mener à l’inhibition de la signalisation de la voie PI3K/Akt de l’insuline et du PDGF-BB en hypoxie. Aucune variation de l’expression de SHP-1 n’a été observée mais son activité phosphatase en hypoxie était fortement inhibée en NG contrairement en HG où on observait une augmentation de cette activité. Finalement, une association a été constatée entre SHP-1 et la sous-unité bêta du récepteur au PDGF. En conclusion, nous avons démontré que l’augmentation de l’activité phosphatase de SHP-1 en hypoxie cause l’inhibition des voies de l’insuline et du PDGF-BB réduisant les processus angiogéniques des cellules musculaires lisses vasculaires dans la maladie des artères périphériques.

Comprendre l’interaction entre la douleur et le système moteur : une étude novatrice combinant la stimulation magnétique transcrânienne et l’électroencéphalographie

Résumé : L’interaction entre la douleur et le système moteur est bien connue en clinique et en réadaptation. Il est sans surprise que la douleur est un phénomène considérablement invalidant, affectant la qualité de vie de ceux et celles qui en souffrent. Toutefois, les bases neurophysiologiques qui sous-tendent cette interaction demeurent, encore aujourd’hui, mal comprises. Le but de la présente étude était de mieux comprendre les mécanismes corticaux impliqués dans l’interaction entre la douleur et le système moteur. Pour ce faire, une douleur expérimentale a été induite à l’aide d’une crème à base de capsaïcine au niveau de l’avant-bras gauche des participants. L'effet de la douleur sur la force des projections corticospinales ainsi que sur l’activité cérébrale a été mesuré à l’aide de la stimulation magnétique transcrânienne (TMS) et de l’électroencéphalographie (EEG), respectivement. L’analyse des données EEG a permis de révéler qu'en présence de douleur aiguë, il y a une augmentation de l’activité cérébrale au niveau du cuneus central (fréquence têta), du cortex dorsolatéral préfrontal gauche (fréquence alpha) ainsi que du cuneus gauche et de l'insula droite (toutes deux fréquence bêta), lorsque comparée à la condition initiale (sans douleur). Également, les analyses démontrent une augmentation de l'activité du cortex moteur primaire droit en présence de douleur, mais seulement chez les participants qui présentaient simultanément une diminution de leur force de projections corticales (mesurée avec la TMS t=4,45, p<0,05). Ces participants ont également montré une plus grande connectivité entre M1 et le cuneus que les participants dont la douleur n’a pas affecté la force des projections corticospinales (t=3,58, p<0,05). Ces résultats suggèrent qu’une douleur expérimentale induit, chez certains individus, une altération au niveau des forces de projections corticomotrices. Les connexions entre M1 et le cuneus seraient possiblement impliquées dans la survenue de ces changements corticomoteurs.

Formation de centres quaternaires entièrement carbonés et dérivations d’ions iminiums encombrés

Le projet présenté au cours de cette thèse porte sur la formation de centres quaternaires entièrement carbonés. Plusieurs axes d’approche ont été établis, et seront présentés par chapitre : le premier fait état de l’utilisation d’une réaction de Vilsmeier-Haack, le second rapporte la fabrication de nouveaux catalyseurs pour la réaction de condensation de Claisen et le dernier utilise la réaction de Vilsmeier-Haack pour la formation d’acides [béta]-aminés non-racémiques. Lors du premier chapitre, le sujet abordé sera l’utilisation de la réaction de Vilsmeier-Haack pour la formation de composés 1,3-dicarbonylés contenant un centre quaternaire entièrement carboné. D’abord nous verrons comment, théoriquement, la chiralité du centre quaternaire peut être contrôlée par l’utilisation d’amines chirales. Puis nous suivrons le développement d’une méthode d’hydrolyse spécifique à l’obtention de composés 1,3-dicarbonylés avec ses forces et ses limites. La deuxième partie de cette thèse portera sur le développement de nouveaux catalyseurs pour la réaction de condensation de Claisen. Plusieurs avenues seront exposées. Dans un premier temps, nous verrons la rationalisation validant chacune des idées d’avenues envisagées, puis nous aborderons les méthodes de synthèses essayées pour les catalyseurs imaginés dans chacune de ces avenues. Le dernier chapitre portera sur la formation de dérivés d’acides [béta]-aminés non-racémiques via l’utilisation d’une réaction de Vilsmeier-Haack. Dans un premier temps, différentes méthodes de réduction applicables à cette réaction seront présentées, et ensuite, le concept d’un nouveau groupe protecteur spécifique aux ions iminiums sera démontré.

Prévention de la migration radio-induite des cellules cancéreuses du sein

Le cancer du sein triple négatif (TNBC) représente entre 15-20% des cancers du sein et est l'un des types les plus agressifs. De plus, un sous-groupe de ces patientes est résistant à la radiothérapie (RT) et développe fréquemment une récidive hâtive de la maladie. Des études précédentes ont démontré que l’inflammation induite par la RT accélère la progression du cancer et le développement des métastases. Cette hypothèse a donc été validée dans un modèle pré-clinique de TNBC en implantant les cellules de carcinome de souris triple négatives D2A1 dans les glandes mammaires de la souris Balb/c. Premièrement, la tumeur primaire à été irradiée à une dose sous-curative une semaine post-implantation des cellules. En deuxième lieu, le tissu mammaire de la souris a été pré-irradié avant d'implanter les cellules cancéreuses afin de bien discerner l'effet du microenvironnement irradié sur celles-ci. Ces deux modèles ont mené à une augmentation significative des cellules tumorales circulantes ainsi que du nombre de métastases pulmonaires. Plusieurs molécules inflammatoires dont l'interleukine-1 bêta (IL-1β), l'interleukine-6 (IL-6) ou encore la cyclooxygénase 2 (COX-2) ont été identifiées comme facteurs clés impliqués dans la migration radio-induite des cellules cancéreuses du sein. Conséquemment, un inhibiteur large-spectre comme la chloroquine (CQ), entre autres utilisé comme traitement anti-malarien et anti-inflammatoire, a su prévenir ces effets secondaires associés à la RT. Étant donné que l'action de la CQ est peu sélective, une répression de l'expression de l'ARNm de la métalloprotéinase (MMP) de membrane de type 1 (MT1-MMP), une MMP de surface impliquée notamment dans la migration cellulaire, l'invasion tumorale et l'angiogenèse, a été réalisée afin d'éclaircir le mécanisme d'inhibition des métastases radio-induites. Cette répression de la MT1-MMP prévient la formation des métastases pulmonaires radio-induites, démontrant ainsi un des mécanisme important de l'invasion radio-induite. Ce résultat confirme donc l'importance de la MT1-MMP dans ce phénomène et son potentiel comme biomarqueur de prédiction de l'efficacité des traitements de RT, particulièrement chez les patientes atteintes de TNBC.

Sur l'estimation du rapport de deux paramètres d'intensité poissonniens et l'estimation par fonctions de masse prédictives

Ce mémoire est consacré à l'étude du modèle statistique bivarié duquel sont issues deux variables aléatoires conditionnellement indépendantes de loi de Poisson, dont les taux ne sont pas nécessairement égaux. Tout au long de ce mémoire, l'emphase est mise sur le développement d'un cadre bayésien au problème d'estimation paramétrique pour un tel modèle. Deux thèmes principaux y sont abordés : l'inférence statistique du rapport des deux paramètres d'intensité poissonniens et les densités prédictives. Ces problèmes surviennent notamment dans le contexte d'estimation de l'efficacité d'un vaccin développé par Laurent (Laurent, 2012) de même que Laurent et Legrand (Laurent et Legrand, 2012), ou encore, par celui d'estimation de l'efficacité d'un traitement contre le cancer par Lindley (Lindley, 2002). Alors que, dans ces articles, aucune contrainte paramétrique n'est imposée sur le rapport des deux taux poissonniens, une partie du mémoire abordera également ces thèmes lorsqu'il y a une contrainte restreignant le domaine du rapport sur l'intervalle $[0,1]$. Il sera alors possible d'établir des liens avec un article sur les files d'attente d'Armero et Bayarri (Armero et Bayarri, 1994).

Étude des phénomènes d'entartrage de la gibbsite sur les surfaces métalliques

Le procédé Bayer est cyclique et il permet d'extraire les hydrates d'alumine, contenu dans le minerai de bauxite. L'alumine est la matière première nécessaire pour la production de l'aluminium métallique par le procédé d'électrolyse. La solubilisation des hydrates d'alumine est effectuée dans une solution d'hydroxyde de sodium concentrée, liqueur Bayer, à haute température et pression. Il existe deux types de procédé : un procédé dit à basse température (150ÀC) et un procédé dit haute température (250ÀC). Selon la température utilisée, certaines impuretés présentes dans la bauxite vont être solubilisées comme par exemple la silice, le fer ou le titane. Comme le procédé est basé sur la solubilisation puis sur la précipitation des hydrates d'alumine, la solution est chauffée puis refroidie par une série d'échangeurs de chaleur. Ces changements de température impliquent des variations dans les conditions de saturation et sursaturation ce qui va conséquemment causer la formation de tartre dans le procédé. Selon la température du procédé utilisé, la composition chimique du tartre formé peut être différente. Dans le but d'inhiber partiellement ou totalement la cristallisation de la gibbsite, ou hydrate d'alumine, sur les surfaces métalliques, la compréhension des paramètres influençant sa formation est nécessaire. L'un des moyens de réduire ou d'inhiber la formation du tartre est de modifier les énergies de surface entre les surfaces métalliques et la solution de liqueur Bayer. Pour ce faire, des métaux ayant des propriétés différentes seront étudiés en entartrage et des composés organiques seront ajoutées à la solution d'hydroxyde de sodium afin de modifier l'interface entre ces métaux et la solution. L'influence des hydrates d'alumine et des différents composés organiques sur les métaux sera déterminer [i.e. déterminée] par des mesures d'isothermes d'adsorption, de potentiels zêta et d'angles de contact, dans le but d'établir une corrélation entre l'interface métal/solution et les temps de nucléation mesurés en entartrage. Un deuxième volet consiste en la fabrication d'un montage en laboratoire permettant d'effectuer la formation reproductible du tartre de freudenbergite. La freudenbergite est un tartre à base de titane qui se forme dans le procédé à haute température. Cette étude démontre que la formation du tartre dans le procédé Bayer est un phénomène de formation de cristaux de gibbsite en solution qui vont adhérer aux défauts de surfaces des surfaces métalliques. En ce sens, la rugosité de surface des métaux est le facteur déterminant pour la formation du tartre dans le procédé Bayer. Des tests d'entartrage réalisés au laboratoire sur cinq métaux différents démontrent une corrélation évidente entre la rugosité de surface, mesurée par microscope à force atomique, et les temps de nucléation obtenus en entartrage. Les mesures d'interactions interfaciales des aluminates de sodium sur les métaux étudiés, en présence ou non de composés organiques, ne permettent pas d'établir de corrélation avec les temps de nucléation obtenus en entartrage. Par contre, l'allongement de l'entartrage en présence de gluconate et de tartrate de sodium, des composés inhibiteurs de croissance des cristaux de gibbsite, confirme le phénomène de formation du tartre par des cristaux formés en solution. La croissance des cristaux de tartre étant partiellement inhibée, les temps de nucléation vont être allongés lors des tests d'entartrage. À l'inverse, l'EDTA favorise la formation de plusieurs cristaux en solution, ce qui diminue significativement la vitesse d'entartrage lorsqu'elle est ajoutée dans la liqueur Bayer. Afin de confirmer que la rugosité de surface est le facteur prédominant dans la formation du tartre dans le procédé Bayer, dans nos conditions de laboratoire, des tests d'entartrage sont effectués sur une surface d'or recouverte d'une monocouche d'alcane thiols. Ces tests démontrent que le changement de nature de la surface d'or ne permet pas de changer significativement le temps de nucléation de l'or dans nos conditions d'entartrage. Un montage expérimental comportant un four et quatre autoclaves, contrôlé par un système informatique a permis d'effectuer la formation de tartre de freudenbergite de façon reproductible au laboratoire.

Caractérisation structurale de Miz-1 dans le cadre de la répression génique causée par le complexe c-Myc/Miz-1

Résumé : c-Myc est un facteur de transcription (FT) dont les niveaux cellulaires sont dérégulés dans la majorité des cancers chez l’homme. En hétérodimère avec son partenaire obligatoire Max, c-Myc lie préférentiellement les séquences E-Box (CACGTG) et cause l’expression de gènes impliqués dans la biosynthèse des protéines et des ARNs, dans le métabolisme et dans la prolifération cellulaire. Il est maintenant bien connu que c-Myc exerce aussi son potentiel mitogène en liant et inhibant différents FTs impliqués dans l’expression de gènes cytostatiques. Entre autres, c-Myc est en mesure d’inhiber Miz-1, un FT comportant 13 doigts de zinc de type Cys2-His2 (ZFs) impliqué dans l’expression de plusieurs gènes régulateurs du cycle cellulaire comprenant les inhibiteurs de CDK p15[indice supérieur INK4], p21[indice supérieur CIP1] et p57[indice supérieur KIP2]. Plus récemment, il fut démontré qu’en contrepartie, Miz-1 est aussi en mesure de renverser les fonctions activatrices de c-Myc et de prévenir la prolifération de cellules cancéreuses dépendantes de c-Myc. Ces différentes observations ont mené à la suggestion de l’hypothèse intéressante que la balance des niveaux de Miz-1 et c-Myc pourrait dicter le destin de la cellule et a permis d’établir Miz-1 comme nouvelle cible potentielle pour le développement d’agents anti-cancéreux. Malgré le fait que ces deux protéines semblent centrales à la régulation du cycle cellulaire, les mécanismes moléculaires leur permettant de s’inhiber mutuellement ainsi que les déterminants moléculaires permettant leur association spécifique demeurent assez peu documentés pour le moment. De plus, la biologie structurale de Miz-1 demeure à être explorée puisque qu’aucune structure de ses 13 ZFs, essentiels à sa liaison à l’ADN, n’a été déterminée pour l’instant. Les travaux réalisés dans le cadre cette thèse visent la caractérisation structurale et biophysique de Miz-1 dans le contexte de la répression génique causée par le complexe c-Myc/Miz-1. Nous présentons des résultats d’éxpériences in vitro démontrant que Miz-1 interagit avec c-Myc via un domaine contenu entre ses ZFs 12 et 13. De plus, nous démontrons que Miz-1 et Max sont en compétition pour la liaison de c-Myc. Ces résultats suggèrent pour la permière fois que Miz-1 inhibe les activités de c-Myc en prévenant son interaction avec son partenaire obligatoire Max. De plus, ils laissent présager que que Miz-1 pourrait servir de référence pour le développement d’inhibiteurs peptidiques de c-Myc. Finalement, nous avons réalisé la caractérisation structurale et dynamique des ZFs 1 à 4 et 8 à 10 de Miz-1 et avons évalué leur potentiel de liaison à l’ADN. Les résultats obtenus, couplés à des analyses bio-informatiques, nous permettent de suggérer un modèle détaillé pour la liaison spécifique de Miz-1 à son ADN consensus récemment identifié.

Élucidation et identification des différents interacteurs impliqués dans le mécanisme de régulation du LDLR par la protéine PCSK9

Résumé : Les maladies cardiovasculaires représentent la principale cause de mortalité mondiale, soit le tiers des décès annuels selon l’Organisation mondiale de la Santé. L’hypercholestérolémie, caractérisée par une élévation des niveaux plasmatiques de lipoprotéines de faible densité (LDL), est l’un des facteurs de risque majeur pour les maladies cardiovasculaires. La proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) joue un rôle essentiel dans l’homéostasie du cholestérol sanguin par la régulation des niveaux protéiques du récepteur LDL (LDLR). PCSK9 est capable de se lier au LDLR et favorise l’internalisation et la dégradation du récepteur dans les lysosomes. L’inhibition de PCSK9 s’avère une cible thérapeutique validée pour le traitement de l’hypercholestérolémie et la prévention des maladies cardiovasculaires. Par contre, plusieurs mécanismes responsables de la régulation et la dégradation du complexe PCSK9-LDLR n’ont pas encore été complètement caractérisés comme la régulation par la protéine annexin A2 (AnxA2), un inhibiteur endogène de PCSK9. De plus, plusieurs évidences suggèrent la présence d’une ou plusieurs protéines, encore inconnues, impliquées dans le mécanisme d’action de PCSK9. Celles-ci pourraient réguler l’internalisation et le transport du complexe PCSK9-LDLR vers les lysosomes. Les objectifs de cette thèse sont de mieux définir le rôle et l’impact de l’AnxA2 sur la protéine PCSK9 en plus d’identifier de nouveaux partenaires d’interactions de PCSK9 pour mieux caractériser son mécanisme d’action sur la régulation des niveaux de LDLR. Nous avons démontré que l’inhibition de PCSK9 par l’AnxA2 extracellulaire s’effectue via sa liaison aux domaines M1+M2 de la région C-terminale de PCSK9 et nous avons mis en évidence les premières preuves d’un contrôle intracellulaire de l’AnxA2 sur la traduction de l’ARNm de PCSK9. Nos résultats révèlent une liaison de l’AnxA2 à l’ARN messager de PCSK9 qui cause une répression traductionnelle. Nous avons également identifié la protéine glypican-3 (GPC3) comme un nouveau partenaire d’interaction extracellulaire avec le PCSK9 et intracellulaire avec le complexe PCSK9-LDLR dans le réticulum endoplasmique des cellules HepG2 et Huh7. Nos études démontrent que GPC3 réduit l’activité extracellulaire de PCSK9 en agissant comme un compétiteur du LDLR pour la liaison avec PCSK9. Une meilleure compréhension des mécanismes de régulation et de dégradation du complexe PCKS9-LDLR permettra de mieux évaluer l’impact et l’efficacité des inhibiteurs de la protéine PCSK9.