Caractérisation structurale de Miz-1 dans le cadre de la répression génique causée par le complexe c-Myc/Miz-1

Résumé : c-Myc est un facteur de transcription (FT) dont les niveaux cellulaires sont dérégulés dans la majorité des cancers chez l’homme. En hétérodimère avec son partenaire obligatoire Max, c-Myc lie préférentiellement les séquences E-Box (CACGTG) et cause l’expression de gènes impliqués dans la biosynthèse des protéines et des ARNs, dans le métabolisme et dans la prolifération cellulaire. Il est maintenant bien connu que c-Myc exerce aussi son potentiel mitogène en liant et inhibant différents FTs impliqués dans l’expression de gènes cytostatiques. Entre autres, c-Myc est en mesure d’inhiber Miz-1, un FT comportant 13 doigts de zinc de type Cys2-His2 (ZFs) impliqué dans l’expression de plusieurs gènes régulateurs du cycle cellulaire comprenant les inhibiteurs de CDK p15[indice supérieur INK4], p21[indice supérieur CIP1] et p57[indice supérieur KIP2]. Plus récemment, il fut démontré qu’en contrepartie, Miz-1 est aussi en mesure de renverser les fonctions activatrices de c-Myc et de prévenir la prolifération de cellules cancéreuses dépendantes de c-Myc. Ces différentes observations ont mené à la suggestion de l’hypothèse intéressante que la balance des niveaux de Miz-1 et c-Myc pourrait dicter le destin de la cellule et a permis d’établir Miz-1 comme nouvelle cible potentielle pour le développement d’agents anti-cancéreux. Malgré le fait que ces deux protéines semblent centrales à la régulation du cycle cellulaire, les mécanismes moléculaires leur permettant de s’inhiber mutuellement ainsi que les déterminants moléculaires permettant leur association spécifique demeurent assez peu documentés pour le moment. De plus, la biologie structurale de Miz-1 demeure à être explorée puisque qu’aucune structure de ses 13 ZFs, essentiels à sa liaison à l’ADN, n’a été déterminée pour l’instant. Les travaux réalisés dans le cadre cette thèse visent la caractérisation structurale et biophysique de Miz-1 dans le contexte de la répression génique causée par le complexe c-Myc/Miz-1. Nous présentons des résultats d’éxpériences in vitro démontrant que Miz-1 interagit avec c-Myc via un domaine contenu entre ses ZFs 12 et 13. De plus, nous démontrons que Miz-1 et Max sont en compétition pour la liaison de c-Myc. Ces résultats suggèrent pour la permière fois que Miz-1 inhibe les activités de c-Myc en prévenant son interaction avec son partenaire obligatoire Max. De plus, ils laissent présager que que Miz-1 pourrait servir de référence pour le développement d’inhibiteurs peptidiques de c-Myc. Finalement, nous avons réalisé la caractérisation structurale et dynamique des ZFs 1 à 4 et 8 à 10 de Miz-1 et avons évalué leur potentiel de liaison à l’ADN. Les résultats obtenus, couplés à des analyses bio-informatiques, nous permettent de suggérer un modèle détaillé pour la liaison spécifique de Miz-1 à son ADN consensus récemment identifié.

Effet de différents ratios d’acides linoléique/α-linolénique et de l’entérolactone sur les marqueurs du métabolisme des lipides, d’inflammation et de stress oxydatif dans un modèle in vitro de culture de tissus hépatiques bovins

Chez la vache laitière à haut rendement, la période de transition entourant la parturition est généralement accompagnée d’un déficit énergétique, d’un métabolisme des lipides perturbé et d’une augmentation de l’inflammation et du stress oxydatif. Afin d’améliorer la balance énergétique et de diminuer certains effets négatifs associés à la période de transition, il est fréquent que les producteurs administrent des diètes riches en lipides (ex. Mégalac®, riche en acide palmitique) aux vaches laitières à haut rendement. Par exemple, l’ajout de lipides saturés à la ration améliore la balance énergétique et diminue l’accumulation des triglycérides dans le foie. Cependant, plusieurs troubles métaboliques demeurent, tels que l’inflammation et le stress oxydatif, pouvant être observés entre autres au niveau du foie. Comme alternative aux lipides saturés, l’ajout d’acides gras polyinsaturés (AGPIs) pourrait contribuer à améliorer la balance énergétique tout en diminuant certains effets négatifs associés à la période de transition. Toutefois, les AGPIs sont sujets aux phénomènes de peroxydation ce qui pourrait augmenter le stress oxydatif chez l’animal. Pour limiter ces dommages oxydatifs, l’utilisation de la graine de lin entière, riche en acides gras oméga-3 (n-3) et en lignans (antioxydants), en supplément alimentaire apparaît comme une avenue prometteuse. Des travaux antérieurs rapportent qu’une supplémentation en différents dérivés de la graine de lin (ex. AGPIs, lignans) module l’expression de certains gènes impliqués dans la réponse au stress oxydatif et le métabolisme des lipides dans la glande mammaire de la vache laitière. Cependant, il n’existe aucune étude rapportant l’effet de divers composés de la graine de lin sur le métabolisme lipidique et certains marqueurs de stress oxydatif dans le foie de la vache laitière. Ce projet de recherche a été réalisé afin de déterminer les effets de différents ratios d’acides linoléique (LA)/acide alpha-linolénique (ALA) (n-6/n-3, AGPI) en présence ou non d’entérolactone (ENL, lignan mammalien) sur (1) l’expression hépatique de gènes liés au métabolisme des lipides, au processus inflammatoire et au stress oxydatif, (2) les dommages aux lipides et aux protéines et (3) l’activité de l’enzyme superoxyde dismutase (SOD) dans le foie de la vache laitière en début de lactation. Un modèle in vitro de culture de tissu hépatique en tranches minces a été utilisé puisqu’il permet de préserver les interactions cellules-matrice et entre les cellules. Les gènes sélectionnés ont été choisis en se référant à diverses études antérieures et incluent certains gènes différentiellement exprimés dans le foie et la glande mammaire de la vache laitière en période de transition. Des régulateurs de la transcription (ex. MLXIPL et SREBF1), de même que leurs gènes cibles ont été priorisés. Les tissus issus de biopsies hépatiques de vaches Holstein en début de lactation ont été mis en culture et soumis à huit traitements composés de différents ratios d’AGPIs n-6/n-3, d’ENL et d’une combinaison des deux. Suite à ces traitements, les niveaux d’ARNm des gènes sélectionnés ont été mesurés par PCR quantitatif (RT-qPCR). Les dommages aux lipides ont été mesurés par l’essai des « thiobarbituric acid reactive substances » (TBARS) et les dommages aux protéines par une analyse des protéines carbonyles. Finalement, un essai enzymatique a été effectué pour mesurer l’activité de la SOD, une enzyme jouant un rôle dans le système de défense contre les radicaux libres. Les résultats de cette étude démontrent que l’ajout d’AGPIs (LA et ALA) dans le milieu de culture augmente l’expression de certains gènes liés au stress oxydatif (NQO1, PRDX3, PTGS2 et SOD1) et diminue l’expression de plusieurs gènes liés à l’activité lipogénique (ACACA, FASN, SCD et SREBF1). L’addition d’ENL dans le milieu de culture augmente l’abondance de l’ARNm des gènes cibles de MLXIPL, soit FASN et SCD, deux gènes impliqués dans l’activité lipogénique. Cette régulation à la hausse suggère qu’une supplémentation en tourteau ou en farine de lin (riche an lignans) en début de lactation pourrait avoir des effets non désirés et augmenter le risque de stéatose hépatique. Les analyses de peroxydation des lipides ont révélés une augmentation des dommages aux lipides en présence des AGPIs et un retour aux valeurs du traitement contrôle lorsque l’ENL est ajouté aux AGPIs. Une augmentation similaire est observée pour l’activité de la SOD avec l’ajout des AGPIs au milieu de culture, ainsi qu’un retour aux valeurs contrôle lorsque l’ENL est ajouté aux AGPIs. Ces résultats suggèrent qu’une supplémentation en graines de lin entières serait bénéfique en début de lactation puisque les AGPIs pourraient diminuer l’activité lipogénique au niveau du foie, alors que les lignans présents naturellement dans l’écorce de la graine de lin, pourraient réduire le stress oxydatif et les dommages aux lipides provoqués par des niveaux élevés en AGPIs.

Étude des mécanismes de rétention du récepteur opioïde delta

Les médicaments de type opioïde représentent la classe de médicaments la plus utilisée pour les douleurs modérées à sévères. C’est pour cette raison que les opioïdes et leurs récepteurs sont très étudiés et qu’il y a beaucoup de publications sur ces récepteurs. En revanche, peu d’études ont cherché à identifier les partenaires d’interactions de ces récepteurs puis à comprendre les mécanismes d’adressage à la membrane. Même si le récepteur opioïde delta (DOPr) n’est pas encore ciblé en clinique, beaucoup d’équipes s’intéressent à son rôle et à l’effet d’agonistes DOPr dans le but de trouver une nouvelle avenue thérapeutique contre la douleur. Cependant, en condition normale, les agonistes DOPr ont un faible potentiel analgésique, expliqué par le faible niveau de DOPr à la surface cellulaire des neurones. C’est pourquoi il est important de comprendre son adressage à la membrane afin de combiner les traitements aux agonistes DOPr à une thérapie qui augmenterait l’expression de surface du récepteur. De plus, on sait qu’il existe un mécanisme de régulation de l’adressage de DOPr à la surface mais il reste peu compris. Nous avons donc analysé par spectrométrie de masse le complexe protéique résultant de l’immunoprécipitation de FlagDOPr, surexprimé dans des cellules HEK293, afin d’identifier de nouveaux partenaires d’interaction. Dans cette analyse, plusieurs protéines appartenant au complexe vésiculaire COPI ont été identifiées. Nous avons montré dans l’article que DOPr interagit avec COPI via les domaines intracellulaires 2 et 3 et que ces sites d’interaction sont responsables de la rétention de DOPr. De plus, mes travaux se sont penchés sur la régulation de DOPr à la surface cellulaire, telle que l’interaction DOPr avec les protéines cdk5 et pin1, deux protéines pouvant faire partie d’un mécanisme impliqué dans la régulation du transport de DOPr à la surface cellulaire. Comprendre l’export de DOPr est important pour le développement de nouvelles thérapies contre la douleur et plusieurs théories ont été abordées dans le cadre de mes travaux de maîtrise.

Expérimentation de stratégies cognitives et métacognitives dans l'apprentissage de l'analyse littéraire chez des élèves qui redoublent le cours d'Écriture et littérature au cégep.

Le premier cours de français obligatoire, Écriture et littérature, amène l'élève à rédiger une analyse littéraire. La méthode de travail intellectuel que l'élève aura maîtrisée doit être réinvestie dans les cours suivants auxquels de nouvelles notions s'ajoutent. Il importe donc que l'élève ait intégré une méthode de travail efficace qu'il pourra réutiliser. Cet essai vient montrer dans quelle mesure l'utilisation de stratégies cognitives et métacognitives peut aider l'élève à développer sa compétence à rédiger des analyses littéraires. La problématique de la recherche concerne l'approche pédagogique offerte habituellement dans ce premier cours de français. Nous avons remarqué que l'enseignante ou l'enseignant s'intéresse principalement à la tâche réalisée, soit la rédaction de l'élève, et non à la démarche de ce dernier. Si l'élève suit une procédure qui comporte des lacunes ou omet certaines étapes essentielles, comment peut-on espérer que ce dernier arrive à produire une analyse littéraire satisfaisante? Parallèlement, si l'enseignante ou l'enseignant souhaite apporter une aide personnalisée à l'élève, il lui faut avoir accès aux processus mentaux de ce dernier. Nous avons aussi remarqué que l'élève n'est guère impliqué dans le processus d'évaluation, qu'il s'agisse de l'évaluation de sa démarche ou de son texte. Ainsi la réflexion sur son savoir-faire ou sur sa compétence en rédaction n'est pas sollicitée. Tel que donné, le cours de littérature n'offre pas une place suffisamment grande au processus d'apprentissage de l'analyse littéraire: l'élève est absent du processus d'évaluation et la réflexion sur sa démarche et ses productions n'est pas valorisée. Dans ce cas, l'enseignante ou l'enseignant ne peut espérer un transfert des apprentissages dans le cours suivant. Ces constats nous ont amenée à souhaiter analyser les effets de l'enseignement de diverses stratégies cognitives et métacognitives sur le développement de la compétence à rédiger des analyses littéraires. Afin de répondre à cet objectif général de la recherche, nous avons bâti notre cadre de référence autour de l'approche cognitiviste. Comme notre expérimentation porte principalement sur l'acquisition de connaissances procédurales, c'est à dire un savoir-faire, nous avons repris les grands principes du traitement de l'information proposés par Tardif (1992). Nous avons aussi tenu compte des catégories de connaissances (Barbeau, Montini, Roy, 1997) qui exigent, pour chacune, des stratégies différentes. Puisque notre expérimentation vise une méthode d'enseignement différente compte tenu que nous avons ajouté des stratégies d'autoévaluation et de régulation à nos stratégies cognitives déjà existantes, nous avons privilégié les écrits d'auteurs qui traitent de la métacognition dans le but de développer une compétence. Alors que l'autoévaluation permet à l'élève d'évaluer sa démarche ou son travail, la régulation, quant à elle, est l'action qui devrait suivre en vue d'apporter des correctifs aux lacunes relevées. Ces deux pratiques indissociables devraient permettre à l'élève de réaliser quelles actions il doit mettre en place pour améliorer ses écrits. Ainsi l'élève prend confiance en lui, devient plus autonome et responsable de sa réussite. C'est dans cette optique que s'est déroulée l'expérimentation à l'hiver 2008. Pendant 15 semaines, 25 élèves regroupés à l'intérieur d'un cours d'aide à la réussite ont expérimenté une approche différente de celle du cours dans lequel ils ont échoué. D'abord, l'élève a pris connaissance de ses points forts et de ses faiblesses à l'analyse littéraire du trimestre précédent. Il a pu s'exprimer sur sa conception des critères d'évaluation et ajuster sa compréhension des attentes par la suite. Après chaque production, l'élève a été appelé à porter un jugement critique sur son texte. Aussi, il a pu parler de sa méthode de travail avec ses pairs et évaluer l'efficacité de sa démarche. La réécriture de certains textes a été exigée. À plusieurs reprises, l'élève a dû se questionner sur l'état de ses apprentissages et faire le bilan de ses connaissances. Le travail par les pairs a aussi été très valorisé. Pour vérifier l'impact de notre expérimentation, nous avons recueilli tous les documents relatifs à l'analyse littéraire finale de mai 2008 afin de décrire les processus mentaux mis en place par les élèves et vérifier si leurs stratégies ont été efficaces. Nous avons aussi fait remplir deux questionnaires afin d'analyser les perceptions des élèves quant aux stratégies cognitives et métacognitives expérimentées. Finalement, lors d'une entrevue, l'enseignante nous a fait part de ses perceptions quant à l'intérêt de la recherche et ses limites. Les résultats que nous avons obtenus nous ont permis de voir quelle démarche chaque élève a suivie à partir des traces qu'il a laissées. Il semble que les étapes préalables à la rédaction, celles que l'on retrouve sur la copie de l'extrait littéraire, sont les stratégies les plus utiles pour recueillir toutes les informations nécessaires à la rédaction. Les élèves qui ont laissé des traces de ces étapes sont ceux qui ont le mieux réussi. Cependant, c'est sur le plan des perceptions qu'apparaît encore plus clairement l'importance de combiner les stratégies métacognitives aux stratégies cognitives déjà en place. Les élèves accordent une grande valeur à l'autoévaluation. Cette pratique semble avoir contribué à augmenter leur confiance alors qu'ils sont aptes à détecter leurs forces et leurs faiblesses. Aussi, plusieurs croient que le réinvestissement de cette stratégie dans les autres cours de français pourra les aider dans leur réussite. De manière générale, l'expérimentation de stratégies métacognitives conjointement aux stratégies cognitives donne de bons résultats. Même si l'expérimentation s'est effectuée sur une courte période, elle a eu un impact positif chez les élèves et l'enseignante. Les élèves avaient le sentiment d'être en contrôle de leur réussite. Bref, les résultats nous encouragent donc à poursuivre l'insertion de stratégies métacognitives à l'intérieur du premier cours de français afin d'aider les élèves à acquérir une méthode de travail qui leur sera utile et efficace.