In vitro propagation of insectivorous plants for phytochemical purposes

Dissertação mest., Engenharia Biológica, Universidade do Algarve, 2009

Compostagem e caracterização de resíduos vegetais para utilização como substratos hortícolas

O objectivo deste trabalho foi estudar a utilização de 5 compostos de resíduos de origem vegetal, como componentes de substratos hortícolas. Estudaram-se os processos de compostagem de bagaço de azeitona, bagaço de uva, polpa de alfarroba, casca de eucalipto e casca de pinheiro, caracterizaram-se os compostos obtidos e testou-se a sua aptidão agronómica, como substratos para viveiro de tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) em placas alveoladas e cultura de pelargónio (Pelargonium x hortorum) em vaso. Após uma preparação prévia, que em alguns dos resíduos vegetais constou de moenda, suplemento de azoto e aumento do teor de humidade, efectuou-se a sua compostagem em caixas com 1200 L de capacidade, isoladas termicamente, com arejamento por volteio manual. Depois foram analisadas as suas características físicas e químicas e testados na sua aptidão como constituintes únicos de substratos e em misturas com turfa de sphagnum. A maioria dos processos de compostagem apresentou uma evolução habitual da temperatura, com a máxima aproximando-se ou ultrapassando 60 oC. Como excepções, verificou-se um período de compostagem muito longo em bagaço de azeitona; o atraso da fase termofílica em polpa de alfarroba e, na 1ª compostagem de casca de pinheiro, a temperatura não alcançou a zona termofílica. A maioria dos resíduos manifestaram uma acentuada resistência à degradação durante a compostagem, à excepção da polpa de alfarroba e da casca de eucalipto. Contudo, a nível físico-químico e químico registaram-se evoluções acentuadas, sobretudo nas variáveis relacionadas com alterações da superfície das partículas, como por exemplo, a capacidade de troca catiónica. Outras variáveis apresentaram uma evolução interessante para o acompanhamento do processo e o conhecimento do grau de estabilidade do composto final. Foi apreciável o efeito proporcionado pela adição de lamas de estação de tratamento de águas residuais urbanas, como suplemento azotado, a nível das propriedades físicas dos compostos, do aumento da velocidade do processo de compostagem e do enriquecimento dos compostos em macro e micronutrientes. A compostagem não conduziu à melhoria significativa das propriedades físicas dos materiais, excepto em casca de eucalipto. Os compostos caracterizaram-se fundamentalmente por uma reduzida capacidade de retenção de água e uma elevada capacidade de arejamento. Os compostos obtidos com incorporação de lamas apresentaram os valores mais baixos de capacidade de arejamento, mesmo assim dentro dos limites satisfatórios e, os valores mais altos de capacidade de retenção de água. Na cultura em placas alveoladas, o comportamento de muitas das misturas com compostos não se diferenciou do da testemunha, observando-se uma flutuação sazonal do comportamento das misturas nos dois viveiros de cada ano, associada às condições ambientais mais exigentes do ponto de vista da disponibilidade de água. Observou-se um maior número de correlações significativas entre as características dos substratos e as variáveis relativas ao crescimento das plantas nos viveiros efectuados mais tarde, sob condições de maior evapotranspiração. As plantas obtidas no segundo viveiro de tomate foram instaladas em cultura. As características das plantas do viveiro, apresentaram elevada correlação com as respectivas produções obtidas no campo, evidenciando a importância da qualidade das plantas de viveiro, na produção. Nos ensaios de pelargónio em vaso, também se observaram comportamentos idênticos ao da testemunha em muitas das misturas com compostos. Observou-se no 2º ensaio, um maior número de tratamentos com resultados idênticos aos da testemunha, resultante das condições de menor exigência hídrica, as quais fizeram sobressair menos as diferenças de propriedades físicas das misturas. Contudo, a diferença de crescimento obtido em algumas misturas, atribuiu-se também à interferência da continuidade capilar entre o vaso de papel com a estaca enraizada e a mistura em estudo. O trabalho presente mostrou que é possível obter compostos a partir de resíduos orgânicos, com boas características e a preço competitivo para utilização como substratos hortícolas. O processo de compostagem sendo um elemento chave, é fácil de controlar se houver uma regulação eficaz do arejamento e do teor de humidade durante o processo. Apesar de alguns resíduos, como a polpa de alfarroba, serem caros, se tomarmos em consideração o custo da sua eliminação, poderão conduzir a substratos comercialmente viáveis. Em condições ambientais que favoreçam uma maior evapotranspiração ou, em culturas com maior exigência hídrica, pode ser aconselhável a mistura dos compostos estudados com turfa de sphagnum pouco decomposta para melhorar a capacidade de retenção de água.

Study of transcripts and reactive oxygen species involved in the defence responses of Quercus suber against Phytophthora cinnamomi

The present work has the merit of exploring an insight into the activation of defence genes of Quercus suber during response to infection by Phytophthora cinnamomi. Thus, cDNA-AFLP methodology was used to identify gene fragments differentially present in the mRNA profiles of host cells of micropropagated Q. suber plantlets roots infected with zoospores of P. cinnamomi at different post challenge time points. Six candidate genes were selected based on their interesting cDNA-AFLP expression patterns and homology to genes known to play a role in defence. These six genes encode a cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (QsCAD2), a protein disulphide isomerase (QsPDI), a CC-NBS-LRR resistance protein (QsRPc), thaumatin-like protein (QsTLP), chitinase (QsCHI) and a 1,3-beta glucanase (QsGLU). The current work has been successful in evaluation of the expression of these genes by qRT-PCR. Data analysis revealed that transcript levels of QsRPc, QsCHI, QsCAD2 and QsPDI increased during the early hours of inoculation, while transcript profiles of thaumatin-like protein showed decreasing. No expression was detected for 1,3-beta-glucanase (QsGLU). Furthermore, the choice of suitable reference genes in any new experimental system is absolutely crucial in qRT-PCR; for this reason in this study and for the first time a set of potential reference genes were analyzed and validated for qRT-PCR normalization in the patho-system Phytophthora-Q. suber. Four candidate reference genes polimerase II (QsRPII), eukaryotic translation initiation factor 5A(QsEIF-5A), b-tubulin (QsTUB) and a medium subunit family protein of Clathrin adaptor complexes (QsCACs) were evaluated to determine the most stable internal references in Q. suber. Analysis of stability of genes was carried out using Genex software. Results indicated all these four potential reference genes assumed stable expression. Data analysis revealed that QsRPII and QsCACs were the two most stable genes, while genes QsTUB and QsEIF-5A were the third and the fourth most stable gene, respectively. In this study, a plasmid-based quantitative PCR method was developed to measure P. cinnamomi colonization during infection process of Q. suber. Plasmid-based detection of P. cinnamomi showed a gradual accumulation of the pathogen DNA in cork oak root tips up to 24 h post infection. The higher increase in P. cinnamomi/plasmid DNA ratio occurred between 18 and 24 h. One of the primary objectives of this research was to study the effect of cinnamomins (elicitins secreted by P. cinnamomin) on inducing defence mechanism against the pathogen, as recent histological and ultra-structural studies showed that P. cinnamomi was restricted to the outer cortex root fragments pre-treated with capsicien and cryptogein, suggesting that elicitins can stimulate plant defence reactions against P. cinnamomi. To complement these studies and to have a clear view of the nature of the interaction, the role of cinnamomins in the production of the oxidative burst [ROS and ROS scavenging enzymes such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD)] and in the defence responses was evaluated. Cork oak seedlings were pretreated with alpha-cinnamomin and then inoculated with P. cinnamomi mycelia. Results showed a significant higher production of reactive oxygen species (ROS) (H2O2 and O2•-) in elicitin and non-elicitin treated roots in interaction with P. cinnamomi in comparison to the corresponding control. The plant group inoculated with the pathogen after cinnamomin treatment showed an earlier increase in H2O2 production but this was lower as compared with that group inoculated with P. cinnamomi alone. Also, in elicitin pre-treated group generally, a lower level of O2•− production during infection was observed as compared with inoculated roots with P. cinnamomi alone without elicitin treatment. Furthermore, in this study, we evaluated activities of antioxidant enzymes upon challenge with P. cinnamomi, with and without pretreatment with alpha cinnamomin. Results indicated that the activities of defense enzymes POD, SOD and CAT increased after P. cinnamomi inoculation when compared with those in the control group. Also, in the group treated with alpha-cinnamomin followed by P. cinnamomi inoculation, a higher level of enzymatic activities was detected as compared with elicitin non-treated group, which suggest the protective effect of alpha-cinnamomin against the pathogen due to higher elevated levels of defense enzymes POD, SOD and CAT during the infection period. Furthermore, a sensitive qPCR method was applied to measure the pathogen biomass in elicited and non-elicited Q. suber roots challenged with P. cinnamomi to elucidate the effect of cinnamomins on the colonization of P. cinnamomi. Plasmid-based quantification of P. cinnamomi showed a significant decrease in accumulation of the pathogen DNA in cork oak roots after treatment with alpha and beta-cinnamomins which attest the role of cinnamomins in promoting defense responses in cork oak against P. cinnamomi invasion.