Mapeamento genómico de um gene de resistência ao míldio em Brassica oleracea L.

Tese dout., Biologia, Universidade do Algarve, 2006

Identificação de marcadores moleculares ligados a um gene mutado de resistência ao oídio (Erysiphe pisi Syd.) em ervilha (Pisum sativum L.)

Tese dout., Ciências Agrárias, Universidade do Algarve, 2006

Produção de um agente de controlo biológico de doenças pós-colheita, em reactor biológico, a partir de resíduos de alfarroba. Estudos de transferência de massa.

Dissertação mest., Engenharia Biológica, Universidade do Algarve, 2009

Técnicas biomoleculares no diagnòstico e tipificação em virologia vegetal

Tese de dout., Ciências Agrárias (Protecção de Plantas), Unidade de Ciências e Tecnologias Agrárias, Univ. do Algarve, 1994

Produção de metabolitos de stress por culturas de células em suspençaõ de Ononis natrix L. SSP. Ramosíssima e Hyoscyamus albus L.

Dissertação de dout., Bioquímica Vegetal (Biotecnologia Vegetal), Univ. do Algarve, 1994

Caracterização fisiológica e nutritiva da clorose férrica em citrinos: avaliação dos mecanismos de resistência aos efeitos do HCO3

Tese de dout., Ciências Agrárias, Unidade de Ciências e Tecnologias Agrárias (Produção Vegetal), Univ. do Algarve, 2000

Variabilidade genómica de Citrus tristeza virus e transformação genética de Citrus aurantium L. com vista à obtenção de resistência

Tese de dout., Biologia, Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais, Univ. do Algarve, 2003

Dissection of the early steps in the assembly of the 20S proteasome in Saccharomyces cerevisiae

Tese de dout., Bioquímica (Biologia Celular e Molecular), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2010

Autophagy in hypothalamic cells: role of Neuropeptide Y

Dissertação de mest.Ciências Biomédicas. Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Univ. do Algarve, 2011

O Remexido e a resistência miguelista no Algarve

Artigo científico sobre a acção político-militar de José Joaquim de Sousa Reis, depois transformado no herói popular que o vulgo designava por Remexido, famoso guerrilheiro que sustentou a causa miguelista até ao fim do período histórico conhecido por Setembrimo. Foi, e ainda é, uma das mais carismáticas figuras da história regional algarvia, retratado em diversas obras da literatura portuguesa, desde o séc. XIX até à actualidade.

Study of transcripts and reactive oxygen species involved in the defence responses of Quercus suber against Phytophthora cinnamomi

The present work has the merit of exploring an insight into the activation of defence genes of Quercus suber during response to infection by Phytophthora cinnamomi. Thus, cDNA-AFLP methodology was used to identify gene fragments differentially present in the mRNA profiles of host cells of micropropagated Q. suber plantlets roots infected with zoospores of P. cinnamomi at different post challenge time points. Six candidate genes were selected based on their interesting cDNA-AFLP expression patterns and homology to genes known to play a role in defence. These six genes encode a cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (QsCAD2), a protein disulphide isomerase (QsPDI), a CC-NBS-LRR resistance protein (QsRPc), thaumatin-like protein (QsTLP), chitinase (QsCHI) and a 1,3-beta glucanase (QsGLU). The current work has been successful in evaluation of the expression of these genes by qRT-PCR. Data analysis revealed that transcript levels of QsRPc, QsCHI, QsCAD2 and QsPDI increased during the early hours of inoculation, while transcript profiles of thaumatin-like protein showed decreasing. No expression was detected for 1,3-beta-glucanase (QsGLU). Furthermore, the choice of suitable reference genes in any new experimental system is absolutely crucial in qRT-PCR; for this reason in this study and for the first time a set of potential reference genes were analyzed and validated for qRT-PCR normalization in the patho-system Phytophthora-Q. suber. Four candidate reference genes polimerase II (QsRPII), eukaryotic translation initiation factor 5A(QsEIF-5A), b-tubulin (QsTUB) and a medium subunit family protein of Clathrin adaptor complexes (QsCACs) were evaluated to determine the most stable internal references in Q. suber. Analysis of stability of genes was carried out using Genex software. Results indicated all these four potential reference genes assumed stable expression. Data analysis revealed that QsRPII and QsCACs were the two most stable genes, while genes QsTUB and QsEIF-5A were the third and the fourth most stable gene, respectively. In this study, a plasmid-based quantitative PCR method was developed to measure P. cinnamomi colonization during infection process of Q. suber. Plasmid-based detection of P. cinnamomi showed a gradual accumulation of the pathogen DNA in cork oak root tips up to 24 h post infection. The higher increase in P. cinnamomi/plasmid DNA ratio occurred between 18 and 24 h. One of the primary objectives of this research was to study the effect of cinnamomins (elicitins secreted by P. cinnamomin) on inducing defence mechanism against the pathogen, as recent histological and ultra-structural studies showed that P. cinnamomi was restricted to the outer cortex root fragments pre-treated with capsicien and cryptogein, suggesting that elicitins can stimulate plant defence reactions against P. cinnamomi. To complement these studies and to have a clear view of the nature of the interaction, the role of cinnamomins in the production of the oxidative burst [ROS and ROS scavenging enzymes such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD)] and in the defence responses was evaluated. Cork oak seedlings were pretreated with alpha-cinnamomin and then inoculated with P. cinnamomi mycelia. Results showed a significant higher production of reactive oxygen species (ROS) (H2O2 and O2•-) in elicitin and non-elicitin treated roots in interaction with P. cinnamomi in comparison to the corresponding control. The plant group inoculated with the pathogen after cinnamomin treatment showed an earlier increase in H2O2 production but this was lower as compared with that group inoculated with P. cinnamomi alone. Also, in elicitin pre-treated group generally, a lower level of O2•− production during infection was observed as compared with inoculated roots with P. cinnamomi alone without elicitin treatment. Furthermore, in this study, we evaluated activities of antioxidant enzymes upon challenge with P. cinnamomi, with and without pretreatment with alpha cinnamomin. Results indicated that the activities of defense enzymes POD, SOD and CAT increased after P. cinnamomi inoculation when compared with those in the control group. Also, in the group treated with alpha-cinnamomin followed by P. cinnamomi inoculation, a higher level of enzymatic activities was detected as compared with elicitin non-treated group, which suggest the protective effect of alpha-cinnamomin against the pathogen due to higher elevated levels of defense enzymes POD, SOD and CAT during the infection period. Furthermore, a sensitive qPCR method was applied to measure the pathogen biomass in elicited and non-elicited Q. suber roots challenged with P. cinnamomi to elucidate the effect of cinnamomins on the colonization of P. cinnamomi. Plasmid-based quantification of P. cinnamomi showed a significant decrease in accumulation of the pathogen DNA in cork oak roots after treatment with alpha and beta-cinnamomins which attest the role of cinnamomins in promoting defense responses in cork oak against P. cinnamomi invasion.

In vitro blood-brain barrier models to predict the permeation of gene therapy vectors into the brain

A terapia génica tem-se revelado uma alternativa relevante no tratamento de doenças neurodegenerativas (DN). Contudo, a entrega de vetores para transferência génica no cérebro representa ainda um enorme desafio devido à presença da barreira hemato-encefálica (BHE). A BHE é uma interface dinâmica e seletiva entre o sangue e o cérebro, constituída pelas células endoteliais cerebrais, astrócitos e pericitos, desempenhando um importante papel na regulação da homeostasia cerebral. A BHE representa um dos maiores obstáculos no tratamento de DN, uma vez que esta barreira impede o transporte para o cérebro da maioria das moléculas terapêuticas, incluindo os vetores para terapia génica. Embora tenham sido desenvolvidos diferentes modelos in vitro da BHE de forma a avaliar o transporte de fármacos através da BHE, muito poucos foram criados com o intuito de testar a permeabilidade desta barreira a vetores de terapia génica. O presente trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento e a avaliação de modelos in vitro de BHE que permitam a investigação da capacidade dos vetores de terapia génica de penetrarem no cérebro. No nosso estudo, foram testados diferentes modelos in vitro de BHE em monocultura, constituídos por células endoteliais de rato ou murganho (RBE4 e bEnd3, respetivamente), e modelos de co-cultura, que combinam células endoteliais com células neuronais (Neuro2a) ou astrócitos primários, cultivados num sistema transwell. Para caraterizar estes modelos foram realizados testes de permeabilidade e de resistência elétrica transendotelial, bem como estudos baseados na técnica de PCR quantitativo e na imunocitoquímica das proteínas das junções intercelulares. Verificámos que os modelos baseados na cultura de células bEnd3 e células neuronais ou astrócitos apresentavam as melhores propriedades de barreira. Posteriormente foi avaliada nos modelos selecionados a penetração de um vetor não-viral que reconhecidamente tem a capacidade de atravessar in vivo a BHE: o peptídeo da glicoproteína do vírus da raiva (RGV-9r). Os siRNAs marcados com um fluoróforo e acoplados ao peptídeo RVG-9r foram capazes de penetrar eficientemente as células bEnd3, localizadas no lado luminal do insert, via endocitose mediada por recetores, e ainda de penetrar os astrócitos ou células neuronais, previamente cultivadas no lado abluminal. Estes resultados correlacionam-se, de forma clara, com os resultados previamente descritos em estudos in vivo. Em conclusão, os modelos in vitro de BHE baseados na co-cultura de células bEnd3 com células Neuro2a ou astrócitos, têm grande potencial na seleção de candidatos a vetores de terapia génica para o cérebro, uma vez que apresentam importantes características da BHE e se baseiam num método fácil e reprodutível. Tal facto representa uma promessa significativa para a identificação de novas estratégias de terapia génica não invasiva para o tratamento de doenças neurológicas.

Farmacogenómica do eixo renina angiotensina: relevância na suscetibilidade e terapêutica da hipertensão arterial

As doenças cardiovasculares (DCVs) apresentam-se como uma das principais causas de morte e incapacidade na maioria dos países desenvolvidos. A hipertensão arterial (HTA) é um fator de risco que contribui grandemente para o desenvolvimento destas doenças, tendo estado associado, em 2004, a aproximadamente 51% das mortes por doença cerebrovascular, 45% das mortes por doença coronária e 7.5 milhões de mortes prematuras no mundo. Em Portugal, a prevalência de HTA ultrapassa os 40% na população adulta. A terapêutica farmacológica, como os inibidores da enzima de conversão da angiotensina (IECAs) e os antagonistas dos recetores da angiotensina II (ARAs), apesar de serem utilizados como fármacos de 1ª linha e de serem determinantes na evolução positiva das DCV, continuam longe dos efeitos desejados de controlo e tratamento. A variada etiologia da HTA contribui para o difícil tratamento. A farmacogenómica tem vindo a tornar-se uma ferramenta extremamente útil na deteção de grupos populacionais em risco e com fraca resposta ao tratamento, pelo que a sua prática no meio clínico deve ser privilegiada. Deste modo, este estudo incidirá sobre os polimorfismos em genes que integram o eixo renina angiotensina (ERA) – farmacodinâmica (PD) - e também sobre as alterações nos genes que podem estar envolvidos na metabolização e transporte dos fármacos anti-hipertensivos – farmacocinética (PK). Exemplos de algumas destas alterações genéticas foram já descritas na literatura. Um polimorfismo do tipo inserção/deleção (I/D) no gene que codifica a enzima de conversão da angiotensina (ECA), leva ao aumento dos níveis plasmáticos desta e da pressão arterial (PA), originando resistência ao tratamento com IECAs; o polimorfismo 1166A>C no recetor do tipo 1 da angiotensina II (R1AII) leva ao aumento da sua expressão, e por conseguinte, a uma resposta mais efetiva aos ARAs; e a alteração -5312C>T no gene que codifica para a renina (REN) conduz ao aumento da expressão desta, podendo o paciente deixar de responder a concentrações padrão de antagonistas da REN. Em termos de PK, polimorfismos nos enzimas metabolizadores dos ARAs como é o caso do CYP 2C9*2 e CYP 2C9*3 levam ao fenótipo de metabolizador lento (PM) e, por conseguinte a possíveis efeitos tóxicos e inesperados. Também a variante do transportador de influxo OATP1B1*1B tem sido descrita como um fator de variabilidade na PK do valsartan e temocapril. Assim, com o desenvolvimento desta monografia, pretende-se estudar como os diferentes polimorfismos existentes nestes genes podem influenciar na suscetibilidade à HTA e na sua terapêutica.

Isolamento e produção de agentes de controlo biológico das principais doenças de pós-colheita, em citrinos e pomóideas

Potenciais agentes de biocontrolo foram isolados a partir da microbiota epifítica de folhas e frutos, de citrinos e pomóideas, de diferentes pomares, durante diferentes campanhas e de distintas condições de armazenamento. A atividade antagonista de 1465 microrganismos isolados foi testada em ensaios in vivo em pomóideas face a Penicillium expansum (104 esporos/ml) e em citrinos face a P. digitatum (105 esporos/ml) em frutos feridos e inoculados artificialmente. Aproximadamente 7,6% dos isolados reduziu a severidade (diâmetro da podridão) e a incidência (% podres) em mais de 25%, menos de 3% reduziu ambos os parâmetros em mais de 50%, mas apenas 4 microrganismos preencheram os critérios de seleção, redução da incidência e severidade em mais de 75%. Dos 4 e pelos resultados obtidos em ensaios de seleção secundária e de determinação da concentração mínima eficaz, destacaram-se e selecionaram-se 2 microrganismos, uma bactéria isolada de laranjas „Valencia late‟ e identificada como pertencente ao grupo das Enterobactérias, Pantoea agglomerans PCB-1 e uma levedura isolada a partir da superfície de maças 'Bravo de Esmolfe' identificada como Metschnikowia andauensis PBC-2, com o objetivo de usar dois modelos distintos de agentes de biocontrol, uma bactéria e uma levedura. P. agglomerans é um agente de biocontrolo já conhecido. A estirpe PBC-1 isolada neste trabalho mostrou ter elevada eficácia face aos principais agentes patogénicos na póscolheita de citrinos e pomóideas. M. andauensis é uma levedura recentemente descoberta e a estirpe PBC-2 diz respeito à primeira referência desta espécie como agente de biocontrolo, a qual foi recentemente objeto de concessão de Patente de Invenção Nacional nº 105210, como uma nova estirpe desta espécie para uso como agente de biocontrolo das doenças de póscolheita de frutos. A concentração mínima eficaz dos antagonistas revelou estar dentro dos limites para o seu desenvolvimento comercial. M. andauensis PBC-2 quando aplicada à concentração de 5×106 ufc/ml, permitiu uma redução da incidência e da severidade de 62 e 70%, respetivamente, e quando aplicada a 1×107 ufc/ml, uma redução de 90% de incidência e de 95% de severidade. P. agglomerans PBC-1 aplicada a 1 × 108 ufc/ml em maçãs e em citrinos no controlo de P. expansum e P. digitatum, respetivamente, propiciaram uma redução significativa de cerca de 86% de cada um dos agentes patogénicos. O espectro de ação de M. andauensis PBC-2 foi avaliado, verificando-se o controlo efetivo face a Rhizopus stolonifer, P. expansum e Botritys cinerea, em pera 'Rocha' e em diferentes cultivares de maçã e contra P. digitatum e Penicillium italicum em clementinas e laranjas de diferentes cultivares. Durante 4 épocas, a eficácia de M. andauensis PBC-2, foi avaliada e comparada com o fungicida sintético mais usado comercialmente, Imazalil, em ensaios semicomerciais. Os resultados assemelharam-se aos obtidos com o fungicida, a redução da incidência do bolor azul foi de 90% em maças armazenadas durante 3 meses a 1±0.5 ºC, seguido de 7 dias à temperatura ambiente, para simular o tempo de prateleira. Em ensaios do estudo da dinâmica populacional, verificou-se que o agente de biocontrolo M. andauensis PBC-2 tem uma excelente capacidade colonizadora e que consegue crescer e sobreviver nas feridas, mas também na superfície dos frutos, armazenados à temperatura ambiente e em condições de frio. Pelo contrário, M. andauensis PBC- não apresentou capacidade de sobrevivência no suco gástrico simulado, começando a população a diminuir imediatamente após exposição e passadas 48 h não restava população viável. Diferentes meios de cultura usualmente descritos na produção de leveduras foram testados na produção de M. andauensis PBC-2. Aquele que apresentou a maior população viável ao fim de 40 h de incubação foi o meio YPD, entretanto escolhido para estudos posteriores. O pH mais favorável ao crescimento foi de 6,5, não se observando diferenças significativas entre os crescimentos a 25 e 30 ºC. Estudou-se ainda o efeito da concentração das duas fontes de azoto do meio YPD e elegeu-se a combinação de 10 g/l de extrato de levedura e 20 g/l de peptona. Nos estudos de produção de biomassa dos dois potenciais agentes de biocontrolo, analisou-se o efeito da sacarose, frutose e glucose, como fontes de carbono e otimizou-se a concentração destes açúcares no crescimento em Erlenmeyer. Após 20 h de incubação a população viável de P. agglomerans PBC-1 atingiu 3.9×109, 1.5×109, 3.9×109 ufc/ml, respetivamente. No caso de M. andauensis PBC-2, foi obtida a população de 1.2×108, 5.3×108 e 1,3×108 ufc/ml, com glucose, sacarose e frutose, após 40 h. Os resultados permitem concluir que os dois agentes têm capacidade de metabolizar os açúcares testados, contudo e atendendo à produtividade de biomassa, rendimento, disponibilidade e custo, optou-se por usar a sacarose como fonte de carbono nos restantes ensaios, nomeadamente na transição de Erlenmeyer para reator biológico. Na produção de P. agglomerans PBC-1 escolheu-se o meio SAC (5 g/l sacarose e 5 g/l extrato de levedura). O meio YPS (12.5g/l sacarose, 10 g/l extrato de levedura, 20 g/l peptona) foi usado no aumento de escala de M. andauensis PBC-2. A otimização da produção em reator biológico de P. agglomerans PCB-1 foi realizada submetendo o microrganismo a diferentes condições hidrodinâmicas, testando-se arejamentos, dois tipos de turbina (hélice; rusthon) e dispersores (poroso, em L). Foram igualmente estudados, o efeito da concentração inicial do inoculo e a adição programada da fonte de carbono. Embora tenham sido testadas diferentes variações, o perfil dos diferentes parâmetros analisados foi idêntico, a população máxima viável foi de 3-5×109 ufc/ml. A diferença mais notória foi observada na fermentação com concentração inicial de 107 cfu/ml, que permitiu encurtar em cinco horas a fase lag, o que pode significar uma redução de tempo de fermentação, e consequentemente uma redução de custos. Visando a produção de biomassa a baixo custo, fator importante na implementação de um sistema de controlo biológico, estudou-se a possibilidade de utilizar subprodutos e resíduos da indústria alimentar no crescimento dos agentes de biocontrolo. Subprodutos da indústria de alfarroba e subprodutos e resíduos da indústria de sumos de citrinos foram utilizados na produção de P. agglomerans PBC-1 e de M. andauensis PBC-2, respetivamente. Desta forma, para além de uma redução dos custos de produção, pretendeu-se a valorização de um subproduto (no caso de alfarroba e do bagaço de citrinos) e mitigar os efeitos nefastos de um resíduo (licor), com elevada carga poluente, que gera graves problemas ambientais e que pode ditar o encerramento desta unidade industrial, com efeitos devastadores para a economia local. Realizaram-se extrações de subprodutos da indústria de alfarroba, a diferentes razões sólido/líquido, tempos e temperaturas, de forma a maximizar a extração de açúcares. A potencialidade de utilizar o extrato de açúcares obtido, na produção de P. agglomerans PBC-1 foi avaliada, em ensaios de crescimento em Erlenmeyer, com consequente transição para reator mecanicamente agitado. Os perfis de crescimento da cultura crescida com subprodutos da indústria de alfarroba assemelharam-se aos observados com sacarose como fonte de carbono. A biomassa viável produzida com subprodutos da indústria de alfarroba, foi de 4- 7×109 ufc/ml, o que permite concluir que é uma alternativa viável à produção deste microrganismo. A produção de M. andauensis PBC-2 com subprodutos da indústria de sumos de citrinos, foi estudada em Erlenmeyer tendo como objetivo conhecer os perfis de crescimento do microrganismo, bem como, estudar a melhor combinação desta fonte de carbono e sua concentração. O bagaço de citrinos e um resíduo líquido, que se denominou de licor, foram testados com resultados comparáveis à produção obtida com meio usado como standard, (YPS), sem comprometer a atividade antagonista do agente de biocontrolo. Posteriormente, foi realizada a produção em reator mecanicamente agitado, escolhendo-se para tal o meio YL (10 g/l extrato de levedura e licor à concentração de açúcares de 12.5 g/l). Os parâmetros de crescimento da cultura foram semelhantes aos obtidos com a fonte de carbono comercial. Após aproximadamente 40 h de incubação, a população viável de M. andauensis PCB-2 atingiu 3.1×108 ufc/ml. A produtividade de biomassa e rendimento foi de 0.435 g/l.h e 1.502 g/g, respetivamente, comparável a produtividade de biomassa (0.432 g/l.h) e rendimento (1.4416 g/g) observado no meio YPS. Os resultados obtidos, são uma base sólida para o aumento de escala a um nível laboratorial e semi-industrial, permitiram concluir que é exequível produzir M. andauensis a baixo custo e representam uma possível alternativa para um resíduo. Em estudos dos possíveis modos de ação, de M. andauensis PBC-2, conclui-se que, este agente de biocontrolo, não tem como modos de ação a produção de antibióticos ou de voláteis, uma vez que, não se verificou inibição do crescimento dos agentes patogénicos. A competição por ferro e a produção de enzimas líticas por M. andauensis PBC-2 foi estudada em meios com diferentes concentrações de ferro e em um meio de cultura, com paredes celulares de fungos, como única fonte de carbono. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que a produção e secreção de enzimas líticas não é o principal ou o mais importante modo de ação do agente de controlo biológico PBC-2, uma vez que a produção de quitinase observada ao 5 e 7º dia de incubação foi muito baixa, e não foi observada a produção de β-1,3- glucanases e proteases.

Caraterização dos supressores p20 e p23 do Citrus tristeza virus e avaliação da possibilidade da sua inibição

No presente trabalho pretendeu-se caracterizar a capacidade supressora das proteínas p20 e p23 de diferentes grupos filogenéticos do CTV e o possível silenciamento da p23 de forma a ser incluída numa estratégia de proteção. A atividade supressora local da proteína p23 de todos os grupos filogenéticos foi caracterizada em Nicotiana benthamiana da linha 16C. Todas as proteínas testadas foram capaz de suprimir o silenciamento local, mas não o silenciamento a curta distância. A supressão local mais eficiente verificou-se para a p23 do Gp 5 e a menos eficiente para os isolados dos Gps 2 e M. Surpreendentemente, a p23 do Gp 5 aboliu completamente o silenciamento sistémico, sugerindo que existe uma relação entre a intensidade do silenciamento local e sistémico. A capacidade supressora local conjunta das proteínas p20 e p23 foi avaliada. A coexpressão de ambas as proteínas revelou atividade supressora mais forte comparada com a capacidade de cada proteína individual, mesmo quando inoculada com metade da densidade ótica, sugerindo a existência de sinergismo entre as proteínas p20 e p23. Para analisar as propriedades supressoras a longo prazo, as proteínas p20 e p23 foram inseridas no vetor viral TRV que assegurou a sua disseminação pela planta e expressão por um período mais alargado. Foram observados sintomas em N. benthamiana para todas as modalidades testadas, tais como, nanismo da planta, lesões necróticas severas nas folhas inoculadas e nas folhas novas ligeiros sintomas de mosaico e enrolamento. Contudo, sistemicamente não foram registadas diferenças na capacidade supressora das proteínas p20 e p23. A possibilidade para silenciar sistemicamente a proteína p23 quando incluída num genoma viral foi avaliada através do uso de plantas e enxertos transgénicos para a p23. A estratégia que envolve o uso de enxertos transgénicos parece indicar resultados promissores que conduzem ao silenciamento da p23, contudo, são resultados que devem ser encarados como preliminares.