Development of a Piggybac based direct reprogramming system for derivation of integration free induced pluripotent stem cells

Induced pluripotent stem cells (iPSc) have great potential for applications in regenerative medicine, disease modeling and basic research. Several methods have been developed for their derivation. The original method of Takahashi and Yamanaka involved the use of retroviral vectors which result in insertional mutagenesis, presence in the genome of potential oncogenes and effects of residual transgene expression on differentiation bias of each particular iPSc line. Other methods have been developed, using different viral vectors (adenovirus and Sendai virus), transient plasmid transfection, mRNA transduction, protein transduction and use of small molecules. However, these methods suffer from low efficiencies; can be extremely labor intensive, or both. An additional method makes use of the piggybac transposon, which has the advantage of inserting its payload into the host genome and being perfectly excised upon re-expression of the transposon transposase. Briefly, a policistronic cassette expressing Oct4, Sox2, Klf4 and C-Myc flanked by piggybac terminal repeats is delivered to the cells along with a plasmid transiently expressing piggybac transposase. Once reprogramming occurs, the cells are re-transfected with transposase and subclones free of tranposon integrations screened for. The procedure is therefore very labor intensive, requiring multiple manipulations and successive rounds of cloning and screening. The original method for reprogramming with the the PiggyBac transposon was created by Woltjen et al in 2009 (schematized here) and describes a process with which it is possible to obtain insert-free iPSc. Insert-free iPSc enables the establishment of better cellular models of iPS and adds a new level of security to the use of these cells in regenerative medicine. Due to the fact that it was based on several low efficiency steps, the overall efficiency of the method is very low (<1%). Moreover, the stochastic transfection, integration, excision and the inexistence of an active way of selection leaves this method in need of extensive characterization and screening of the final clones. In this work we aime to develop a non-integrative iPSc derivation system in which integration and excision of the transgenes can be controlled by simple media manipulations, avoiding labor intensive and potentially mutagenic procedures. To reach our goal we developed a two vector system which is simultaneously delivered to original population of fibroblasts. The first vector, Remo I, carries the reprogramming cassette and GFP under the regulation of a constitutive promoter (CAG). The second vector, Eneas, carries the piggybac transposase associated with an estrogen receptor fragment (ERT2), regulated in a TET-OFF fashion, and its equivalent reverse trans-activator associated with a positive-negative selection cassette under a constitutive promoter. We tested its functionality in HEK 293T cells. The protocol is divided in two the following steps: 1) Obtaining acceptable transfection efficiency into human fibroblasts. 2) Testing the functionality of the construct 3) Determining the ideal concentration of DOX for repressing mPB-ERT2 expression 4) Determining the ideal concentration of TM for transposition into the genome 5) Determining the ideal Windows of no DOX/TM pulse for transposition into the genome 6) 3, 4 and 5) for transposition out of the genome 7) Determination of the ideal concentration of GCV for negative selection We successfully demonstrated that ENEAS behaved as expected in terms of DOX regulation of the expression of mPB-ERT2. We also demonstrated that by delivering the plasmid into 293T HEK cells and manipulating the levels of DOX and TM in the medium, we could obtain puromycin resistant lines. The number of puromycin resistant colonies obtained was significantly higher when DOX as absent, suggesting that the colonies resulted from transposition events. Presence of TM added an extra layer of regulation, albeit weaker. Our PCR analysis, while not a clean as would be desired, suggested that transposition was indeed occurring, although a background level of random integration could not be ruled out. Finally, our attempt to determine whether we could use GVC to select clones that had successfully mobilized PB out of the genome was unsuccessful. Unexpectedly, 293T HEK cells that had been transfected with ENEAS and selected for puromycin resistance were insensitive to GCV.

Using induced pluripotent stem cells to investigate the mechanistic link between Gaucher disease and Parkinson related synucleinopathies

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015

Establishment of a protocol for the cryopreservation of cell sheets of adipose tissue stem cells

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

Modelação ecológica no estuário do Sado

Os modelos matemáticos são ferramentas poderosas para avaliar o impacto humano em sistemas costeiros e estuarinos de estrutura complexa. Neste artigo utiliza-se um sistema de modelos matemáticos para simular o comportamento hidrodinâmico e biológico do estuário do Sado. Estudos experimentais de análise da evolução da biomassa de fitoplâncton durante os últimos 10 anos indicam que o ecossistema se encontra numa situação relarivamente estável, exibindo pouca tendência para a eutrofização (Cabeçadas, 1993). Neste Artigo procura-se caracterizar o estado trófico do sistema, confirmar as conclusões obtidas experimentalmente e interpretar os processos que ocorrem na região do estuário.

Estudo da viabilidade da construção em alvenaria confinada no Algarve

Os sismos ocorridos nos últimos anos têm demonstrado um comportamento aceitável dos edifícios de pequeno porte, de alvenaria resistente confinada, que diversos estudos experimentais têm vindo a corroborar. No Algarve existe um tipo próprio de construção de pequeno porte, que embora constituindo uma profunda adulteração à construção vernacular, e tendo sido imposto por um impulso turístico pouco sustentado, se encontra abundantemente disseminado e que, por isso mesmo, constitui um conjunto suficientemente homogéneo para justificar uma análise de viabilidade de um processo construtivo. Neste trabalho, apresenta-se um estudo sobre a segurança estrutural de pequenas construções de alvenaria confinada, no enquadramento da referida tipologia e em conformidade com os materiais existentes na região. Procede-se a uma resumida caracterização tipológica dessas construções correntes e apresentam-se os resultados de alguns ensaios experimentais de alvenarias. Com base na tipologia construtiva e nos resultados experimentais, realizaram-se análises sísmicas (numéricas) de uma construção, tendo em vista a verificação da segurança no contexto dos Eurocódigos 6 e 8. Comparam-se, ainda, os resultados obtidos com alvenaria confinada (com elementos confinantes de betão armado), com os de estrutura reticulada em betão armado de baixa ductilidade (com alvenaria de preenchimento não resistente), para a mesma acção. Como consequência, alvitram-se algumas recomendações, visando a optimização dos processos construtivos, de que, eventualmente, as empresas regionais poderão usufruir, aquando da próxima entrada em vigor dos Eurocódigos Estruturais.

Processamento de emoções realizado por sujeitos com traumatismo crânio-encefálico

Tese de dout., Psicologia, Faculdade de Ciências Humanas e Sociais, Univ. do Algarve, 2010

Autophagy in hypothalamic cells: role of Neuropeptide Y

Dissertação de mest.Ciências Biomédicas. Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Univ. do Algarve, 2011

Searching biocompounds in marine natural extracts with potential use in tumor prevention and treatment

Cancer is a multistage process characterized by three stages: initiation, promotion and progression; and is one of the major killers worldwide. Oxidative stress acts as initiator in tumorigenesis; chronic inflammation promotes cancer; and apoptosis inactivation is an issue in cancer progression. In this study, it was investigated the antioxidant, antiinflammatory and antitumor properties of hexane, ether, chloroform, methanol and water extracts of five species of halophytes: A. macrostachyum, P. coronopus, J. acutus, C. edulis and A. halimus. Antioxidant activity was assessed by DPPH• and ABTS•+ methods, and the total phenolics content (TPC) was evaluated by the Folin-Ciocalteau method. The anti-inflammatory activity of the extracts was determined by the Griess method, and by evaluating the inhibition of NO production in LPS-stimulated RAW- 264.7 macrophages. The cytotoxic activity of the extracts against HepG2 and THP1 cell lines was estimated by the MTT assay, and the results obtained were further compared with the S17 non-tumor cell line. The induction of apoptosis of J. acutus ether extract was assessed by DAPI staining. The highest antioxidant activities was observed in C. edulis methanol and the J. acutus ether extracts against the DPPH• radical; and J. acutus ether and A. halimus ether extracts against the ABTS•+ radical. The methanol extracts of C. edulis and P. coronopus, and the ether extract of J. acutus revealed a high TPC. Generally the antioxidant activity had no correlation with the TPC. The A. halimus chloroform and P. coronopus hexane extracts demonstrated ability to reduce NO production in macrophages (> 50%), revealing their anti-inflammatory capacity. The ether extract of J. acutus showed high cytotoxicity against HepG2 cancer cells, with reduced cellular viability even at the lowest concentrations. This outcome was significantly lower than the obtained with the non-tumor cells (S17). This result was complemented by the induction of apoptosis.

Motivação profissional em contexto de educação: o internato médico de medicina geral e familiar

A motivação é essencial ao processo formativo, adquirindo particular relevância no âmbito da educação de indivíduos adultos, em contexto profissional. A percepção empírica da existência de baixos níveis de motivação para a especialidade de Medicina Geral e Familiar nos jovens médicos licenciados justifica a realização da presente investigação. Com a finalidade de analisar a motivação profissional no Internato Médico de Medicina Geral e Familiar, desenvolveu-se uma linha de investigação observacional (2005 – 2010), de natureza quantitativa (transversal e longitudinal), seguida de uma abordagem qualitativa, complementando os seus resultados (triangulação metodológica). O estudo teve como alvo a totalidade da população de médicos internos de Medicina Geral e Familiar que iniciaram a sua formação em 2005, em Portugal continental (N = 228). A colheita de dados realizou-se através de um inquérito (questionário postal), tendo respondido 109 médicos internos (análise quantitativa), seguido de entrevistas semiestruturadas a um grupo de 16 médicos, seleccionados a partir da população-alvo (análise qualitativa). Os resultados desta investigação revelam que, na sua globalidade, a população estudada se encontra motivada para o exercício da especialidade de Medicina Geral e Familiar, contrariamente ao esperado. Contudo, a evolução pouco expressiva das dimensões em estudo, ao longo daquele Internato, sugere uma ausência de influência do mesmo na motivação profissional dos médicos estudados, que consideramos pertinente, atendendo à sua estrutura, organização e programa de formação. Os dados apurados na abordagem qualitativa confirmam a existência de múltiplos factores que influenciam a motivação profissional dos médicos internos ao longo do programa no Internato, apontando o papel crucial do Orientador na manutenção (ou variação) da orientação motivacional da referida população. Limitada pela inexistência de estudos anteriores realizados nesta área em Portugal, esta investigação sugere a necessidade de uma reformulação do Programa de Internato Médico de Medicina Geral e Familiar, que deverá ser centrada na melhor preparação dos seus Orientadores e em estratégias direccionadas para a qualidade da formação dos futuros Médicos de Família, neste país.

Role of Ccbe1 during cardiac differentiation of mouse ESCs

Tese de Doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

Uma abordagem de matabolómica no estudo comparativo do metabolismo de glucose e galactose no patogénico humano Streptococcus pneumoniae

Dissertação mest., Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 2010

Estudos biotecnológicos em Drosophyllum Lusitanicum L. com vista à sua conservação

Tese dout., Biologia - Biotecnologia, Universidade do Algarve, 2007

Formação dos enfermeiros em cuidados paliativos

Dissertação mest., Ciências da Educação, Universidade do Algarve, 2009

Estudos de reactividade em derivados de compostos heterocíclicos

Dissertação mest., Química Orgânica, Universidade do Algarve, 2008

Estudos sobre aproveitamento biotecnológico da quitina produzida por organismos marinhos

Dissertação mest., Biotecnologia, Universidade do Algarve, 2008