Development of a Piggybac based direct reprogramming system for derivation of integration free induced pluripotent stem cells

Induced pluripotent stem cells (iPSc) have great potential for applications in regenerative medicine, disease modeling and basic research. Several methods have been developed for their derivation. The original method of Takahashi and Yamanaka involved the use of retroviral vectors which result in insertional mutagenesis, presence in the genome of potential oncogenes and effects of residual transgene expression on differentiation bias of each particular iPSc line. Other methods have been developed, using different viral vectors (adenovirus and Sendai virus), transient plasmid transfection, mRNA transduction, protein transduction and use of small molecules. However, these methods suffer from low efficiencies; can be extremely labor intensive, or both. An additional method makes use of the piggybac transposon, which has the advantage of inserting its payload into the host genome and being perfectly excised upon re-expression of the transposon transposase. Briefly, a policistronic cassette expressing Oct4, Sox2, Klf4 and C-Myc flanked by piggybac terminal repeats is delivered to the cells along with a plasmid transiently expressing piggybac transposase. Once reprogramming occurs, the cells are re-transfected with transposase and subclones free of tranposon integrations screened for. The procedure is therefore very labor intensive, requiring multiple manipulations and successive rounds of cloning and screening. The original method for reprogramming with the the PiggyBac transposon was created by Woltjen et al in 2009 (schematized here) and describes a process with which it is possible to obtain insert-free iPSc. Insert-free iPSc enables the establishment of better cellular models of iPS and adds a new level of security to the use of these cells in regenerative medicine. Due to the fact that it was based on several low efficiency steps, the overall efficiency of the method is very low (<1%). Moreover, the stochastic transfection, integration, excision and the inexistence of an active way of selection leaves this method in need of extensive characterization and screening of the final clones. In this work we aime to develop a non-integrative iPSc derivation system in which integration and excision of the transgenes can be controlled by simple media manipulations, avoiding labor intensive and potentially mutagenic procedures. To reach our goal we developed a two vector system which is simultaneously delivered to original population of fibroblasts. The first vector, Remo I, carries the reprogramming cassette and GFP under the regulation of a constitutive promoter (CAG). The second vector, Eneas, carries the piggybac transposase associated with an estrogen receptor fragment (ERT2), regulated in a TET-OFF fashion, and its equivalent reverse trans-activator associated with a positive-negative selection cassette under a constitutive promoter. We tested its functionality in HEK 293T cells. The protocol is divided in two the following steps: 1) Obtaining acceptable transfection efficiency into human fibroblasts. 2) Testing the functionality of the construct 3) Determining the ideal concentration of DOX for repressing mPB-ERT2 expression 4) Determining the ideal concentration of TM for transposition into the genome 5) Determining the ideal Windows of no DOX/TM pulse for transposition into the genome 6) 3, 4 and 5) for transposition out of the genome 7) Determination of the ideal concentration of GCV for negative selection We successfully demonstrated that ENEAS behaved as expected in terms of DOX regulation of the expression of mPB-ERT2. We also demonstrated that by delivering the plasmid into 293T HEK cells and manipulating the levels of DOX and TM in the medium, we could obtain puromycin resistant lines. The number of puromycin resistant colonies obtained was significantly higher when DOX as absent, suggesting that the colonies resulted from transposition events. Presence of TM added an extra layer of regulation, albeit weaker. Our PCR analysis, while not a clean as would be desired, suggested that transposition was indeed occurring, although a background level of random integration could not be ruled out. Finally, our attempt to determine whether we could use GVC to select clones that had successfully mobilized PB out of the genome was unsuccessful. Unexpectedly, 293T HEK cells that had been transfected with ENEAS and selected for puromycin resistance were insensitive to GCV.

Prática desportiva, qualidade de vida, violência escolar, composição e satisfaçação corporal dos adolescentes algarvios

Tese de douoramento, Psicologia, Faculdade de Ciências Humanas e Sociais, Universidade do Algarve, 2014

Segurança e eficácia de cosmecêuticos e nutracêuticos utilizados na prevenção e retardamento do fotoenvelhecimento da pele

Dissertação de mestrado, Ciências Farmacéuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Development of gene therapy to deliver the receptor-specific rhTRAIL DHER variant to induce apoptosis in activated hepatic stellate cells for the treatment of liver fibrosis

Dissertação de Mestrado, Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014

Establishment of a protocol for the cryopreservation of cell sheets of adipose tissue stem cells

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

Role of Ccbe1 during cardiac differentiation of mouse ESCs

Tese de Doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

Interfaces humano-computador com reconhecimento de gestos e representação holográfica

Dissertação de mestrado, Engenharia Elétrica e Eletrónica, Instituto Superior de Engenharia, Universidade do Algarve, 2015

Uma abordagem de matabolómica no estudo comparativo do metabolismo de glucose e galactose no patogénico humano Streptococcus pneumoniae

Dissertação mest., Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 2010

Saberes e sabores em Garcia da Orta, Rabelais e Platina

Dissertação de mest., Literatura, Faculdade de Ciências Humanas e Sociais, Universidade do Algarve, 2010

Literatura e filosofia: uma leitura dos romances de Gonçalo M. Tavares

Dissertação de mest., Literatura comparada, Faculdade de Ciências Humanas e Sociais, Universidade do Algarve, 2007

Avaliação de desempenho de estações de tratamento de água para consumo humano

Tese de dout., Ciências e Tecnologias do Ambiente, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2009

Felicidade e tecnologia em fahrenheit 451

A tecnologia faz parte da vida do ser humano, constituindo a força motriz que impulsiona a sua evolução. Paralelamente, a busca da felicidade é uma constante que define o indivíduo, independentemente de diferenças económicas, sociais ou culturais. Todavia, a relação entre felicidade e tecnologia é ambígua, porquanto a última é frequentemente descrita como um meio de atingir a primeira, o que não raras vezes reduz o ser humano à demanda de significado na materialidade dos objectos. A problemática felicidade/tecnologia constitui uma das temáticas de Fahrenheit 451 e o presente trabalho de investigação propõe-se analisar de que modo esta dicotomia é apresentada, tratada e solucionada na referida obra, em que está subjacente a crítica ao efeito nocivo que o excesso de tecnologia pode causar no indivíduo e na sociedade. Em Fahrenheit 451 a tecnologia é apresentada como a antítese da felicidade, que é passível de ser atingida através do regresso à Natureza e do contacto com a literatura e filosofia. Contudo, a tecnologia não é apresentada como um mal per se, mas como uma força neutra, sendo o utilizador responsabilizado pela aplicação daquela e pelas consequências daí resultantes.

Metodologia de avaliação de desempenho regional da sustentabilidade ambiental de instalações de tratamento, transporte e armazenamento de águas para consumo humano

Dissertação de mest., Recursos Hídricos, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

A extraordinária capacidade de perdoar: implicações na (re)construção da felicidade

Hoje, como nunca antes, as ciências humanas e sociais consubstanciam um corpo consistente e unificado de dados rigorosos que sublinham as descrições do “florescimento humano” (flourishing) de quem, surpreendentemente, optou por perdoar, não obstante a complexidade das condições, circunstancias e situações profundamente devastadoras fizessem supor o contrário, e de quem aceitou deixar-se “tocar” pelo acto sublime de ser perdoado. Intacta na densidade do pensamento filosófico e teológico, que irrompeu ao longo da história, a extraordinária arte de perdoar deixou-se escapar dos seus manuais para, também, encontrar o seu devido lugar no sistema de pensamento científico, dentro de um quadro rigoroso e metodológico que configura o actual rumo tomado pelas ciências do funcionamento humano óptimo que consubstancia o emergente movimento da Psicologia Positiva (McCullough, 2000; Peterson & Seligman, 2004; Seligman, 2006). A centralidade deste trabalho inscreve a intencionalidade de analisar a relação entre o fenómeno psicológico do perdão interpessoal e as suas implicações na reconstrução da felicidade daquele cuja praticabilidade dessa “força” positiva se afigura como uma realidade possível, partindo da analise das relações entre variáveis psicológicas (traços de personalidade) e factores sociodemograficos (e.g., a idade, o género, a religiosidade e o envolvimento religioso na práxis da catequese) tanto no perdão disposicional quanto na felicidade ou bem-estar subjectivo e, ainda, na influência que estes dois constructos exercem entre si. Justamente porque uma Psicologia do Perdão encontra não somente a sua raiz no horizonte da Psicologia das Relações Interpessoais mas, na sua inevitabilidade, apela a uma dimensão tanto teológica e espiritual quanto psicossocial (McCullough, 2000, 2001; McCullough et al., 1997, 1998, 2001; McCullough & Worthington, 1999),posicionamos o estudo numa amostra que, por um lado, consubstancia uma forte componente interpessoal na sua profissionalidade (um contexto educativo, um contexto de profissões de ajuda do domínio da saúde e um contexto administrativo) e, por outro lado, inscreve participantes portadores de uma religiosidade que se exprime por um forte envolvimento religioso na práxis da catequese. Foram inquiridos 158 participantes dos três contextos que consubstanciam a amostra global. Para a avaliação das variáveis em estudo que influem na relação entre a “força” do perdão e a felicidade, utilizamos a Escala unifactorial sobre a disposição para o perdão interpessoal (Barros, 2002, 2004), a Escala sobre a propensão para o perdão (Mullet, et al., 2003), o Inventário de Personalidade – NEO-FFI (Costa & McCrae, 1992; Lima & Simões, 2002; Simões et al., 2001), a Escala de satisfação com a Vida (Diener et al., 1985; Simões, 1992) e as Escalas da Afectividade Positiva e da Afectividade Negativa (Watson, Clark, & Tellegen, 1988; Simões, 1993). Se, por um lado, os resultados obtidos sugerem que a “força” do perdão está não apenas positivamente associada com a religiosidade e o envolvimento religioso dos sujeitos mas que, encontra uma maior dependência com os traços de personalidade comparativamente aos factores sociodemográficos, por outro lado, apontam que o perdão disposicional é uma variável preditora na felicidade ou bem-estar subjectivo dos participantes. Estes resultados remetem para importantes implicações. A investigação sobre a temática do perdão interpessoal contribui, de forma significativa, não somente para a construção de uma Psicologia do Perdão no quadro global da Psicologia das Relações Interpessoais e, por extensão, da Psicologia da Educação mas, contemporaneamente, configura um processo psicológico sustentável ao florescimento humano e à felicidade autêntica.

Remoção de cianotoxinas da água para consumo humano em filtros de carvão activado com actividade biológica

A contaminação das águas superficiais com cianotoxinas é um problema em Portugal e no mundo, com tendência crescente em consequência das alterações climáticas. O tratamento convencional da água para consumo humano tem eficácia limitada na remoção de cianotoxinas. Os filtros de carvão activado são uma alternativa promissora se, além da adsorção, se favorecer a biodegradação destes microcontaminantes, fenómenos todavia insuficientemente conhecidos.