Characterization of PPP1 interacting proteins in male reproduction

A fosforilação reversível de proteínas é um importante mecanismo de controlo em eucariotas. A fosfoproteína fosfatase 1 (PPP1) é uma fosfatase de serina/treonina envolvida em vários processos celulares. Existem três isoformas da subunidade catalítica (α/CA, δ/β/CB e γ/CC) com pequenas diferenças nos terminais amino e carboxílico. O gene PPP1CC sofre ainda splicing alternativo para produzir duas isoformas, a PPP1CC1 ubíqua e a PPP1CC2 enriquecida em testículo e específica de esperma. A localização e especificidade de substratos da PPP1 está dependente da formação de complexos oligoméricos com proteínas que interagem com a PPP1 (PIPs). O objetivo principal desta tese foi estudar novas PIPs, específicas de testículo e esperma, a fim de melhor caracterizar o papel desta fosfatase e dos respetivos complexos na reprodução em mamíferos. Com este fim, estudou-se a presença, localização e possíveis funções de uma PIP previamente conhecida, PPP1R2, e de duas novas PIPs, PPP1R2P3 e Tctex1d4. PPP1R2 e PPP1R2P3 estão presentes em esperma humano colocalizando com a PPP1CC2, na cabeça e na cauda. A hipótese é que as holoenzimas localizadas na cabeça terão um papel na reação acrossómica, enquanto que as holoenzimas presentes no axonema são relevantes para o controlo da motilidade flagelar. De seguida foram estudados os pseudogenes da PPP1R2, em termos de história evolutiva e de possíveis funções. Na espécie humana, a PPP1R2 tem 10 pseudogenes, 7 deles específicos de primatas. Estudos de bioinformática e dados de expressão mostram que os PPP1R2P1/P3/P9 são os pseudogenes com maior probabilidade de serem transcritos e traduzidos. Também identificámos o PPP1R2P9 em esperma humano e mostrámos que alguns pseudogenes poderão estar associados a estados fisiopatológicos. Isto indica que o processo de evolução poderá estar ligado á formação de novos genes ou ao controlo do mRNA da PPP1R2. A sobre-expressão da PPP1R2 ou PPP1R2P3 em testículo de ratinho também foi realizada, para caracterizar os mecanismos envolvidas na função dos complexos PPP1R2/PPP1R2P3-PPP1CC2 na espermatogénese e fisiologia dos espermatozoides. A dineína de cadeia leve, Tctex1d4, foi encontrada como interagindo com a PPP1C e como estando presente em testículo de ratinho e em esperma humano. Demonstrámos que a Tctex1d4 e a PPP1 colocalizam no centro organizador de microtúbulos e nos microtúbulos e que o motivo de ligação à PPP1 presente na Tctex1d4 parece ser importante para manter a PPP1 no centro organizador de microtúbulos e/ou para disromper ou atrasar o seu movimento ao longo dos microtúbulos emergentes. Estes resultados abrem novos caminhos para os possíveis papéis do complexo Tctex1d4-PPP1 na dinâmica dos microtúbulos, motilidade do esperma, reação acrossómica e na regulação da barreira hemato-testicular, provavelmente, através da via de sinalização do TGFß. A análise do motivo de ligação à PPP1 mostra que este é altamente conservado entre os mamíferos, com exceção das Pikas, sugerindo que esta perda aconteceu antes da radiação das Pikas, há 6-20 milhões de anos atrás. Através de um rastreio por mutações demonstrámos que a capacidade da Tctex1d4 se ligar à PPP1 é mantida nas Pikas, embora o motivo de ligação à PPP1 esteja disrompido. Este estudo abre portas para novas descobertas na área da reprodução mostrando o papel da PPP1CC2 na espermatogénese e fisiologia do esperma.

Effect of water chemistry on the physiology and toxicity assessment in Daphnia

Todos os sistemas aquáticos estão potencialmente expostos a alterações nos parâmetros da água em consequência de fenómenos ambientais tais como deposição ácida, lixiviação de iões dos solos e alterações climáticas. Dado que os parâmetros químicos da água estão geralmente correlacionados, é pertinente estudar os seus efeitos combinados para o biota aquático. Assim, o principal objetivo desta tese é avaliar a importância ecológica da variação simultânea dos principais parâmetros fisico-químicos da água nos parâmetros de história de vida dos crustáceos tanto na ausência como na presença de metais. Foram estudados os seguintes parâmetros: dureza (0.5 - 3.5 mM), alcalinidade (0.3 - 2.3 mM), pH (5.7 - 9.0) e temperatura (13 - 30ºC). A Daphnia magna foi usada como espécie modelo representando os crustáceos aquáticos. A variação simultânea da dureza e alcalinidade afetou significativamente o crescimento, reprodução e crescimento populacional de Daphnia; no entanto, os efeitos da dureza excederam os efeitos da alcalinidade. Pareceu haver interação entre a dureza e alcalinidade na reprodução dos dafnídeos, o que sugere que os efeitos da variação da dureza para Daphnia e provavelmente outros crustáceos poderão depender do nível de alcalinidade. O pH e dureza da água exerceram efeitos combinados para Daphnia, sendo os efeitos do pH mais pronunciados do que os efeitos da dureza. A diminuição do pH reduziu a sobrevivência, crescimento, reprodução, taxa de ingestão e crescimento populacional dos dafnídeos. No entanto, os efeitos do pH baixo foram mais adversos a baixa dureza, o que sugere uma interação entre estes parâmetros. Assim, a diminuição do pH em lagos de água mole pode ser um estressor determinante para os crustáceos sensíveis à acidez, ameaçando a sua sobrevivência e, consequentemente, afetando a estrutura das cadeias alimentares aquáticas. A temperatura e a química da água (dureza e alcalinidade) interagiram entre si nos parâmetros de história de vida de Daphnia; no entanto, os efeitos da temperatura excederam os efeitos da química da água. De um modo geral, temperaturas extremas reduziram o crescimento, reprodução e, consequentemente, o crescimento populacional de Daphnia. Os efeitos do aumento da temperatura foram mais adversos a baixa dureza e alcalinidade, aumentando a preocupação com os efeitos ecológicos do aquecimento global em águas moles. A dureza e alcalinidade da água também desempenharam um papel importante na toxicidade aguda e subletal (inibição da ingestão) dos metais para Daphnia. A diminuição da dureza aumentou a toxicidade aguda do zinco. Por outro lado, a diminuição da alcalinidade aumentou a toxicidade aguda e subletal do cobre, mas reduziu a toxicidade subletal do zinco, tornando evidente o importante papel da alcalinidade na toxicidade subletal dos metais para Daphnia. Globalmente, os parâmetros fisico-químicos da água parecem interagir entre si, afetando os parâmetros de história de vida e o crescimento populacional de Daphnia e também afetam a toxicidade dos metais. Em particular, a baixa dureza agrava os efeitos adversos da diminuição do pH, aumento da temperatura e toxicidade dos metais, o que aumenta a preocupação com os efeitos ecológicos da sua variação simultânea sobre os crustáceos e, portanto, sobre as cadeias alimentares aquáticas.

Physiology and metabolic profile of Moringa olifera and Eucalyptus globulus plants subjected to climate changes

As alterações climáticas emergentes têm um grande impacto no crescimento e desenvolvimento de espécies florestais, nomeadamente em espécies de valor industrial e medicinal, como é o caso do eucalipto (Eucalyptus globulus) e da moringa (Moringa oleifera). Assim, é urgente conhecer as respostas fisiológicas e entender as variações que ocorrem nos perfis metabólicos de espécies vegetais. Neste trabalho, plantas jovens de Eucalyptus globulus foram expostas a radiação UVB (12kJ/m2) e foram avaliadas as respostas fisiológicas e o perfil metabólico, um e onze dias após a aplicação da radiação. A dose de UVB usada não afetou as reações fotoquímicas nem as trocas gasosas, contudo ao nível do metabolismo do carbono (AST e amido) e do conteúdo de pigmentos verificaram-se pequenas alterações (AST e pigmentos). Através da análise do perfil metabólico de E. globulus foram encontrados compostos voláteis e semi-voláteis pertencentes às famílias dos terpenos, sesquiterpenos e aldeídos. Em geral, os sesquiterpenos e os álcoois monoterpénicos apresentaram uma tendência para manter e, em alguns casos, diminuir com o stress, enquanto que o grupos dos aldeídos aumentou e os monoterpenos apresentaram um comportamento mais heterogéneo. O E. globulus mostrou ser uma espécie tolerante à aplicação da dose de UVB usada neste trabalho. Por outro lado, plantas jovens de M. oleifera foram expostas a défice hídrico (DH). Um grupo de plantas foi recolhido um dia após o final da exposição e o outro grupo após onze dias do final da exposição. Foi avaliado o perfil metabólico desta espécie através de GC/MS. Os dados cromatográficos indicaram que em condições de stress (DH(1) e DH(11)), as quantidades de compostos associados a vias primárias e secundárias de defesa (como os alcanos, álcoois, ácidos carboxílicos, esteróis, aminoácidos e açucares) sofreram algumas alterações. As plantas analisadas 11 dias após a remoção do stress mostraram maiores variações do perfil de metabolitos. No entanto, tanto um como onze dias após a remoção do stress, as plantas apresentaram a formação de novos rebentos. Apesar do perfil de metabolitos ter sofrido algumas alterações, por não se registarem casos de morte, conclui-se que as plantas de moringa mostraram ser tolerantes aos tratamentos aplicados.