Nucella lapillus: imposex transcriptome analysis and phenotypic plasticity

O conhecimento de mecanismos de genómica funcional tem sido maioritariamente adquirido pela utilização de organismos modelo que são mantidos em condições laboratoriais. Contudo, estes organismos não reflectem as respostas a alterações ambientais. Por outro lado, várias espécies, ecologicamente bem estudadas, reflectem bem as interacções entre genes e ambiente mas que, das quais não existem recursos genéticos disponíveis. O imposex, caracterizado pela superimposição de caracteres sexuais masculinos em fêmeas, é induzido pelo tributilestanho (TBT) e trifenilestanho (TPT) e representa um dos melhores exemplos de disrupção endócrina com causas antropogénicas no ambiente aquático. Com o intuito de elucidar as bases moleculares deste fenómeno, procedeu-se à combinação das metodologias de pirosequenciação (sequenciação 454 da Roche) e microarrays (Agilent 4*180K) de forma a contribuir para um melhor conhecimento desta interacção gene-ambiente no gastrópode Nucella lapillus, uma espécie sentinela para imposex. O trancriptoma de N. lapillus foi sequenciado, reconstruído e anotado e posteriormente utilizado para a produção de um “array” de nucleótidos. Este array foi então utilizado para explorar níveis de expressão génica em resposta à contaminação por TBT. Os resultados obtidos confirmaram as hipóteses anteriormente propostas (esteróidica, neuroendócrina, retinóica) e adicionalmente revelou a existência de potenciais novos mecanismos envolvidos no fenómeno imposex. Evidência para alvos moleculares de disrupção endócrina não relacionados com funções reprodutoras, tais como, sistema imunitário, apoptose e supressores de tumores, foram identificados. Apesar disso, tendo em conta a forte componente reprodutiva do imposex, esta componente funcional foi a mais explorada. Assim, factores de transcrição e receptores nucleares lipofílicos, funções mitocondriais e actividade de transporte celular envolvidos na diferenciação de géneros estão na base de potenciais novos mecanismos associados ao imposex em N. lapillus. Em particular, foi identificado como estando sobre-expresso, um possível homólogo do receptor nuclear “peroxisome proliferator-activated receptor gamma” (PPARγ), cuja função na indução de imposex foi confirmada experimentalmente in vivo após injecção dos animais com Rosiglitazone, um conhecido ligando de PPARγ em vertebrados. De uma forma geral, os resultados obtidos mostram que o fenómeno imposex é um mecanismo complexo, que possivelmente envolve a cascata de sinalização envolvendo o receptor retinoid X (RXR):PPARγ “heterodimer” que, até à data não foi descrito em invertebrados. Adicionalmente, os resultados obtidos apontam para alguma conservação de mecanismos de acção envolvidos na disrupção endócrina em invertebrados e vertebrados. Finalmente, a informação molecular produzida e as ferramentas moleculares desenvolvidas contribuem de forma significativa para um melhor conhecimento do fenómeno imposex e constituem importantes recursos para a continuação da investigação deste fenómeno e, adicionalmente, poderão vir a ser aplicadas no estudo de outras respostas a alterações ambientais usando N. lapillus como organismo modelo. Neste sentido, N. lapillus foi também utilizada para explorar a adaptação na morfologia da concha em resposta a alterações naturais induzidas por acção das ondas e pelo risco de predação por caranguejos. O contributo da componente genética, plástica e da sua interacção para a expressão fenotípica é crucial para compreender a evolução de caracteres adaptativos a ambientes heterogéneos. A contribuição destes factores na morfologia da concha de N. lapillus foi explorada recorrendo a transplantes recíprocos e experiências laboratoriais em ambiente comum (com e sem influência de predação) e complementada com análises genéticas, utilizando juvenis provenientes de locais representativos de costas expostas e abrigadas da acção das ondas. As populações estudadas são diferentes geneticamente mas possuem o mesmo cariótipo. Adicionalmente, análises morfométricas revelaram plasticidade da morfologia da concha em ambas as direcções dos transplantes recíprocos e também a retenção parcial, em ambiente comum, da forma da concha nos indivíduos da F2, indicando uma correlação positiva (co-gradiente) entre heritabilidade e plasticidade. A presença de estímulos de predação por caranguejos estimulou a produção de conchas com labros mais grossos, de forma mais evidente em animais recolhidos de costas expostas e também provocou alterações na forma da concha em animais desta proveniência. Estes dados sugerem contra-gradiente em alterações provocadas por predação na morfologia da concha, na produção de labros mais grossos e em níveis de crescimento. O estudo das interacções gene-ambiente descritas acima demonstram a actual possibilidade de produzir recursos e conhecimento genómico numa espécie bem caracterizada ecologicamente mas com limitada informação genómica. Estes recursos permitem um maior conhecimento biológico desta espécie e abrirão novas oportunidades de investigação, que até aqui seriam impossíveis de abordar.

Phenotypic consequences of genome mistranslation in Candida albicans

Várias espécies do género Candida traduzem o codão CUG de leucine como serina. Em C. albicans este codão é traduzido pelo tRNACAG Ser de serina que é reconhecido por leucil- e seril-tRNA sintetases (LeuRS e SerRS), permitindo a incorporação de leucina ou serina em posições com CUG. Em condições padrão de crescimento os codões CUG é incorporam 3% de leucina e 97% de serina, no entanto estes valores são flexíveis uma vez que a incorporação de serina pode variar entre 0.6% e 5% em resposta a condições de stress. Estudos anteriores realizados in vivo em Escherichia coli sugeriram que a ambiguidade em codões CUG é regulada pela SerRS. De facto, o gene da SerRS de C. albicans tem um codão CUG na posição 197 (Ser197) cuja descodificação ambígua resulta na produção de duas isoformas de SerRS. A isoforma SerRS_Leu197 é mais ativa, apesar de menos estável, que a isoforma SerRS_Ser197, suportando a ideia da existência de um feedback loop negativo, envolvendo estas duas isoformas de SerRS, a enzima LeuRS e o tRNACAG Ser, que mantem os níveis de incorporação de leucina no codões CUG baixos. Nesta tese demonstramos que tal mecanismo não é operacional nas células de C. albicans. De facto, os níveis de incorporação de leucina em codões CUG flutuam drasticamente em resposta a alterações ambientais. Por exemplo, a incorporação de leucina pode chegar a níveis de 49.33% na presença de macrófagos e anfotericina B, mostrando a notória tolerância de C. albicans à ambiguidade. Para compreender a relevância biológica da ambiguidade do código genético em C. albicans construímos estirpes que incorporam serina em vários codões. Apesar da taxa crescimento ter sido negativamente afetada em condições padrão de crescimento, as estirpes construídas crescem favoravelmente em várias condições de stresse, sugerindo que a ambiguidade desempenha um papel importante na adaptação a novos nichos ecológicos. O transcriptoma das estirpes construídas de C. albicans e Saccharomyces. cerevisiae mostram que as leveduras respondem à ambiguidade dos codões de modo distinto. A ambiguidade induziu uma desregulação moderada da expressão génica de C. albicans, mas ativou uma resposta comum ao stresse em S. cerevisiae. O único processo celular que foi induzido na maioria das estirpes foi a oxidação redução. De salientar, que enriquecimento em elementos cis de fatores de transcrição que regulam a resposta à ambiguidade em ambas as leveduras foi distinta, sugerindo que ambas respondem ao stresse de modo diferente. Na globalidade, o nosso estudo aprofunda o conhecimento da elevada tolerância à ambiguidade de codões em C. albicans. Os resultados sugerem que este fungo usa a ambiguidade do codão CUG durante infeção, possivelmente para modular a sua interação com o hospedeiro e a resposta a drogas antifúngicas.

Ultrastructure and phylogeny of peridinioid dinoflagellates

Os dinoflagelados são um grupo muito diverso de protistas que possuem um conjunto de características pouco comuns. Os peridinióides são dinoflagelados com teca que é formada por seis séries latitudinais de placas, incluindo a série cingular e um anel incompleto de placas intercalares anteriores, embora as últimas estejam ausentes em algumas espécies de Peridiniopsis. São dinoflagelados com simetria bilateral em relação ao plano apical que contem o eixo dorso-ventral. Na série sulcal há apenas uma placa posterior que contacta com o limite ventral de duas grandes placas antapicais. Entre os peridinióides, a presença ou ausência de um poro apical e o número de placas no cíngulo são geralmente consideradas marcas filogenéticas importantes ao nível de género ou família. Actualmente, a definição de Peridinium Ehrenberg, o dinoflagelado mais comum de água doce, inclui organismos com combinações diferentes destas duas características. Trabalhos anteriores sobre a ultrastrutura e afinidade filogenética das espécies tipo de Peridinium, P. cinctum, e Peridiniopsis Lemmermann, P. borgei também sugerem a necessidade de reexaminar as relações taxonómicas dos peridinióides. Esta tese combina o estudo ultrastrutural de uma selecção de espécies com hipóteses filogenéticas baseadas nas sequências de LSU rDNA, para aumentar o nosso conhecimento das diferenças e afinidades dentro dos peridinióides. Tem como objectivo aumentar o nosso conhecimento das características individuais das células que possam levar a reconhecer sinapomorfias que possam ser usadas como marcadores dos peridinióides como um todo e dos seus subgrupos. As espécies escolhidas para exame pormenorizado foram: Peridinium palatinum Lauterborn, de um grupo com duas placas intercalares anteriores, seis placas cingulares e sem poro apical; Peridinium lomnickii Wo!oszy"ska, de um grupo com poro apical, três placas intercalares e seis cingulares; Peridiniopsis berolinensis (Lemmermann) Bourrelly, uma espécie heterotrófica com poro apical, sem placas intercalares e com seis placas cingulares; e Sphaerodinium cracoviense Wo!oszy"ska, um membro de um género de formas com teca com um tipo de tabulação marginalmente peridinióide, com um suposto poro apical e quatro placas intercalares anteriores. Peridinium palatinum difere de Peridinium e Peridiniopsis típicos, quer em características da teca, quer internas. As diferenças estimadas entre as sequências parciais de LSU rDNA de P. palatinum e a espécie próxima P. pseudolaeve, relativamente a P. cinctum são comparativamente grandes e, juntamente com a topologia da árvore filogenética, apoiam a separação de P. palatinum e formas próximas ao nível de género. Palatinus nov. gen. foi, então, descrito com as novas combinações Palatinus apiculatus nov. comb. (espécie tipo; sin. Peridinium palatinum), P. apiculatus var. laevis nov. comb. e P. pseudolaevis nov. comb.. As características distintivas de Palatinus incluem uma superfície das placas lisa ou um tanto granulosa, mas não areolada, um grande pirenóide central penetrado por canais citoplasmáticos e de onde radiam lobos plastidiais, e a presença de uma fiada microtubular homóloga à de um pedúnculo. As células de Palatinus saem da teca pela zona antapicalpos- cingular. Peridinium lomnickii apresenta tabulação semelhante às formas marinhas, produtoras de quistos calcários, do género Scrippsiella A.R. Loeblich. Para comparação, adicionámos novas observações ultrastruturais de S. trochoidea. Peridinium lomnickii tem uma combinação de características diferente de Peridinium, Peridiniopsis e Scrippsiella. As hipóteses filogenéticas baseadas em DNA colocam P. lomnickii no mesmo ramo que Pfiesteria Steidinger et Burkholder, Tyrannodinium e outras Pfiesteriaceae, com as quais partilha um "microtubular basket" e uma ligação peculiar entre duas placas do sulco. As características distintivas do novo género proposto Chimonodinium gen. ined. incluem, além da tabulação, a ausência de pirenóides, a presença de um "microtubular basket" com quatro ou cinco fiadas sobrepostas de microtúbulos associados a um pequeno pedúnculo, um sistema pusular com tubos pusulares bem definidos ligados aos canais flagelares, e a produção de quistos não calcários. Peridiniopsis berolinensis partilha várias características significativas com Pfiesteria e afins, como um "microtubular basket" com a capacidade de suportar um tubo de alimentação, quimiossensibilidade para encontrar presas apropriadas, o modo de natação junto às presas e a organização geral da célula. Hipóteses filogenéticas com base em LSU rDNA confirmam a afinidade entre P. berolinensis e Pfiesteria bem como a relação mais remota com a espécie tipo de Peridiniopsis, P. borgei. Estas razões justificam a proposta de Tyrannodinium gen. nov., uma nova Pfiesteriaceae que difere de outros membros do grupo por viver em água doce e nos pormenores da tabulação. Sphaerodinium cracoviense revelou a tabulação típica do género Sphaerodinium, que apresenta um número de placas intercalares superiores e pos-cingulares maior que o que é típico em peridinióides: 4 e 6, respectivamente. Observações em SEM mostraram uma estrutura apical diferente da dos peridinióides, e um sulco apical numa das placas fazendo lembrar a área apical de alguns woloszynskióides. Os pormenores do aparelho flagelar e do sistema pusular ligam o Sphaerodinium aos woloszynskióides em geral e ao género Baldinia em particular, mas não aos peridinióides. O volumoso estigma de S. cracoviense revelou ser extraplastidial e de um modelo único, composto por elementos que se encontram em woloszynskióides, mas nunca encontrados anteriormente juntos. A análise filogenética baseada nas sequências parciais de LSU rDNA também sugerem uma maior proximidade de S. cracoviense com os woloszynskióides do que com os peridinióides. Futuras análises pormenorizadas de dinoflagelados peridinióides, em especial entre os do numeroso grupo de espécies com poro apical, serão necessárias para clarificar as suas relações taxonómicas; e a produção de descrições melhoradas das características finas particulares das células serão um requisito para perceber a evolução dos caracteres dos peridinióides por forma a podermos identificar marcadores filogenéticos.

Diversity of Aeromonas species from different environments in Portugal

Espécies de Aeromonas encontram-se distribuídas por diferentes habitats, estando especialmente relacionadas com ambientes aquáticos. O seu papel em complicações na saúde humana e animal é reconhecido. De facto, não só pelo seu potencial de virulência, mas também pelos determinantes genéticos de resistência a antibióticos que possam conter, estes organismos constituem uma preocupação na medicina humana e veterinária. Assim, é essencial o estudo da diversidade de espécies de Aeromonas bem como explorar as suas características fenotípicas e genéticas que podem conduzir a impactos negativos. A água constitui um importante veículo de transmissão de microrganismos e espécies de Aeromonas estão amplamente distribuídas em águas tratadas e não tratadas. Em Portugal é ainda comum o consumo de águas não tratadas cuja qualidade, na maioria das vezes, não é sujeita a monitorização, como acontece por exemplo, em explorações agrícolas de gestão familiar. Neste estudo, investigou-se a presença de Aeromonas em águas não tratadas para consumo. Estabeleceu-se também uma linha horizontal de colheitas de diferentes amostras de origem agrícola com o intuito de avaliar a possibilidade de a água ser uma das vias de contaminação de culturas agrícolas e animais por espécies de Aeromonas. Obtiveram-se 483 isolados que foram discriminados por RAPD-PCR. 169 estirpes distintas foram identificadas ao nível da espécie por análise filogenética baseada no gene gyrB. Verificou-se uma frequente ocorrência bem como uma diversidade considerável de espécies de Aeromonas. Em alguns casos, as relações genotípicas entre isolados de diferentes amostras eram muito próximas. Adicionalmente, a maioria das amostras continha diferentes espécies e estirpes distintas da mesma espécie. A. media e A. hydrophila foram as espécies mais ocorrentes. Um grupo de isolados apresentou variantes moleculares de gyrB diferente das conhecidas até agora, o que indica que poderão constituir espécies não descritas. O perfil de susceptibilidade da colecção de Aeromonas a diferentes antibióticos foi estabelecido, constituindo um perfil típico do género, com algumas excepções. Estirpes multirresistentes foram encontradas. A presença de genes tet e bla foi investigada por estudos de PCR, hibridação e, em alguns casos, de sequenciação. Como era esperado, cphA/imiS foi o mais detectado. A detecção de integrões fez-se por PCR e hibridação e a sua caracterização foi feita por sequenciação de DNA; a sua ocorrência foi reduzida. A maioria das estirpes sintetizou enzimas extracelulares com actividade lipolítica e proteolítica que potencialmente contribuem para virulência. A análise por PCR e hibridação permitiram a detecção de vários determinantes genéticos que codificam moléculas possivelmente envolvidas em processos patogénicos. Diversas espécies de Aeromonas apresentando características relacionadas com resistência a antibióticos e potencialmente de virulência estão frequentemente presentes em produtos para consumo humano e animal em Portugal. ABSTRACT: Aeromonas spp. are present in a wide range of ecological niches, being mainly related to aquatic environments. Their role in human and animal health complications is recognised. In fact, not only for their putative virulence but also for the antibiotic resistance genetic determinants Aeromonas may harbour, these organisms constitute an issue of concern in human and veterinary medicine. Thus, it is essential to get knowledge on Aeromonas sp. diversity and on their genotypic and phenotypic characteristics that may lead to negative impacts. Water constitutes a good contamination route for microorganisms and Aeromonas are widespread in untreated and treated waters from different sources. In Portugal there is still an extensive use of untreated water which is not regularly monitored for quality. This is often the case in family smallholding farms. In this study untreated drinking and mineral waters were assessed for their content in Aeromonas spp. Furthermore, a sampling scheme was designed to investigate the occurrence and diversity of Aeromonas sp. in different agricultural correlated sources and to assess the possibility of water being the transmission vehicle between those sources. 483 isolates were obtained and discriminated by RAPD-PCR. Identification at the species level for 169 distinct strains was done by gyrB based phylogenetic analysis. Results demonstrated the frequent occurrence and considerable diversity of Aeromonas spp. In some cases, genotypic close relations were found between isolates from different sources. Also, most samples contained different species and distinct strains of the same species. A. media and A. hydrophila were the most occurring. A group of isolates displayed gyrB gene sequences distinct from the previously known, indicating that they may constitute representatives of non-described species. The antibiotic susceptibility profile of the aeromonads collection was established and constituted a typical profile of the genus, although few exceptions. Multiresistance patterns were found. The presence of tet and bla genes was investigated by PCR, hybridisation and, in some cases, sequencing analysis. As expected, cphA/imiS was the most detected. Integrons were screened by PCR and hybridisation and characterised by DNA sequencing; low occurrence was recorded. The bulk of strains was able to produce extracellular enzymes with lipolytic and proteolytic activities, which may contribute to virulence. PCR and hybridisation surveys allowed the detection of distinct genetic determinants coding for molecules putatively involved in pathogenic processes. Diverse Aeromonas sp. presenting distinct antibiotic resistance features and putative virulence traits are frequently present in many sources for human and animal consumption in Portugal.

Molecular reconstruction of a genetic code alteration

The genetic code establishes the rules that govern gene translation into proteins. It was established more than 3.5 billion years ago and it is one of the most conserved features of life. Despite this, several alterations to the standard genetic code have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes, namely in the fungal CTG clade where a unique seryl transfer RNA (tRNACAG Ser) decodes leucine CUG codons as serine. This tRNACAG Ser appeared 272±25 million years ago through insertion of an adenosine in the middle position of the anticodon of a tRNACGA Ser gene, which changed its anticodon from 5´-CGA-3´ to 5´-CAG-3´. This most dramatic genetic event restructured the proteome of the CTG clade species, but it is not yet clear how and why such deleterious genetic event was selected and became fixed in those fungal genomes. In this study we have attempted to shed new light on the evolution of this fungal genetic code alteration by reconstructing its evolutionary pathway in vivo in the yeast Saccharomyces cerevisiae. For this, we have expressed wild type and mutant versions of the C. albicans tRNACGA Ser gene into S. cerevisiae and evaluated the impact of the mutant tRNACGA Ser on fitness, tRNA stability, translation efficiency and aminoacylation kinetics. Our data demonstrate that these mutants are expressed and misincorporate Ser at CUGs, but their expression is repressed through an unknown molecular mechanism. We further demonstrate, using in vivo forced evolution methodologies, that the tRNACAG Ser can be easily inactivated through natural mutations that prevent its recognition by the seryl-tRNA synthetase. The overall data show that repression of expression of the mistranslating tRNACAG Ser played a critical role on the evolution of CUG reassignment from Leu to Ser. In order to better understand the evolution of natural genetic code alterations, we have also engineered partial reassignment of various codons in yeast. The data confirmed that genetic code ambiguity affects fitness, induces protein aggregation, interferes with the cell cycle and results in nuclear and morphologic alterations, genome instability and gene expression deregulation. Interestingly, it also generates phenotypic variability and phenotypes that confer growth advantages in certain environmental conditions. This study provides strong evidence for direct and critical roles of the environment on the evolution of genetic code alterations.

Toxicogenomics of natural and anthropogenic effectors in eleutheroembryos

The introduction of chemicals into the environment by human activities may represent a serious risk to environmental and human health. Environmental risk assessment requires the use of efficient and sensitive tools to determine the impact of contaminants on the ecosystems. The use of zebrafish for the toxicity assessment of pharmaceuticals, drugs, and pollutants, is becoming well accepted due to zebrafish unique advantages for the screening of compounds for hazard identification. The aim of the present work is to apply toxicogenomic approaches to identify novel biomarkers and uncovered potential modes of action of classic and emergent contaminants able to disrupt endocrine systems, such as the Retinoic Acid Receptor, Retinoid X Receptor and the Aryl Hydrocarbon Receptor. This study relies on different nuclear and cytosolic protein receptors and other conditional (ligand- or stress- activated) transcriptional factors that are intimately involved in the regulation of defensome genes and in mechanisms of chemical toxicity. The transcriptomic effects of organic compounds, endogenous compounds, and nanoparticles were analysed during the early stages of zebrafish development. Studying the gene expression profiles of exposed and unexposed organisms to pollutants using microarrays allowed the identification of specific gene markers and to establish a "genetic code" for the tested compounds. Changes in gene expression were observed at toxicant concentrations that did not cause morphological effects. Even at low toxicant concentrations, the observed changes in transcript levels were robust for some target genes. Microarray responses of selected genes were further complemented by the real time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) methodology. The combination of bio-informatic, toxicological analyses of differential gene expression profiles, and biochemical and phenotypic responses across the treatments allowed the identification of uncovered potential mechanisms of action. In addition, this work provides an integrated set of tools that can be used to aid management-decision making by improving the predictive capability to measure environmental stress of contaminants in freshwater ecosystems. This study also illustrates the potential of zebrafish embryos for the systematic, large-scale analysis of chemical effects on developing vertebrates.

Molecular genomics of a genetic code alteration

The genetic code is not universal. Alterations to its standard form have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes and demolished the dogma of an immutable code. For instance, several Candida species translate the standard leucine CUG codon as serine. In the case of the human pathogen Candida albicans, a serine tRNA (tRNACAGSer) incorporates in vivo 97% of serine and 3% of leucine in proteins at CUG sites. Such ambiguity is flexible and the level of leucine incorporation increases significantly in response to environmental stress. To elucidate the function of such ambiguity and clarify whether the identity of the CUG codon could be reverted from serine back to leucine, we have developed a forced evolution strategy to increase leucine incorporation at CUGs and a fluorescent reporter system to monitor such incorporation in vivo. Leucine misincorporation increased from 3% up to nearly 100%, reverting CUG identity from serine back to leucine. Growth assays showed that increasing leucine incorporation produced impressive arrays of phenotypes of high adaptive potential. In particular, strains with high levels of leucine misincorporation exhibited novel phenotypes and high level of tolerance to antifungals. Whole genome re-sequencing revealed that increasing levels of leucine incorporation were associated with accumulation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and loss of heterozygozity (LOH) in the higher misincorporating strains. SNPs accumulated preferentially in genes involved in cell adhesion, filamentous growth and biofilm formation, indicating that C. albicans uses its natural CUG ambiguity to increase genetic diversity in pathogenesis and drug resistance related processes. The overall data provided evidence for unantecipated flexibility of the C. albicans genetic code and highlighted new roles of codon ambiguity on the evolution of genetic and phenotypic diversity.

Mitochondrial dysfunction in fatty acid β-oxidation disorders

Mitochondria are central organelles for cell survival with particular relevance in energy production and signalling, being mitochondrial fatty acid β–oxidation (FAO) one of the metabolic pathways harboured in this organelle. FAO disorders (FAOD) are among the most well studied inborn errors of metabolism, mainly due to their impact in health. Nevertheless, some questions remain unsolved, as their prevalence in certain European regions and how pathophysiological determinants combine towards the phenotype. Analysis of data from newborn screening programs from Portugal and Spain allowed the estimation of the birth prevalence of FAOD revealing that this group of disorders presents in Iberia (and particularly in Portugal) one of the highest European birth prevalence, mainly due to the high birth prevalence of medium chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency. These results highlight the impact of this group of genetic disorders in this European region. The characterization of mitochondrial proteome, from patients fibroblasts with FAOD, namely multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MADD) and long chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (LCHADD), provided a global perspective of the mitochondrial proteome plasticity in these disorders and highlights the main molecular pathways involved in their pathogenesis. Severe MADD forms show an overexpression of chaperones, antioxidant enzymes (MnSOD), and apoptotic proteins. An overexpression of glycolytic enzymes, which reflects cellular adaptation to energy deficiency due to FAO blockage, was also observed. When LCHADD fibroblasts were analysed a metabolic switching to glycolysis was also observed with overexpression of apoptotic proteins and modulation of the antioxidant defence system. Severe LCHADD present increased ROS alongside with up regulation of MnSOD while moderate forms have lower ROS and down-regulation of MnSOD. This probably reflects the role of MnSOD in buffering cellular ROS, maintain them at levels that allow cells to avoid damage and start a cellular response towards survival. When ROS levels are very high cells have to overexpress MnSOD for detoxifying proposes. When severe forms of MADD were compared to moderate forms no major differences were noticed, most probably because ROS levels in moderate MADD are high enough to trigger a response similar to that observed in severe forms. Our data highlights, for the first time, the differences in the modulation of antioxidant defence among FAOD spectrum. Overall, the data reveals the main pathways modulated in FAOD and the importance of ROS levels and antioxidant defence system modulation for disease severity. These results highlight the complex interaction between phenotypic determinants in FAOD that include genetic, epigenetic and environmental factors. The development of future better treatment approaches is dependent on the knowledge on how all these determinants interact towards phenotype.!