Novos derivados porfirínicos: síntese e potenciais aplicações em PDT

O trabalho apresentado nesta dissertação descreve estudos desenvolvidos segundo três metodologias para a funcionalização de meso-tetra-arilporfirinas; uma delas baseada na funcionalização com diazo compostos, outra na reacção de Suzuki-Miyaura e a terceira na reacção de metátese. O presente documento é composto por quatro partes distintas. Na primeira parte são feitas considerações gerais sobre propriedades e aplicações de macrociclos porfirínicos. Na segunda parte é apresentado o trabalho realizado na funcionalização de porfirinas com diazo compostos através de reacções de inserção com um catalisador de ródio(II). Este estudo envolveu a preparação de duas porfirinas com grupos O-H e N-H nas posições para dum substituinte meso-fenilo. Os estudos iniciaram-se com a reacção de 5-(4-hidroxifenil)-10,15,20-trifenilporfirinatozinco(II) com diazoacetato de etilo na presença de Rh2(OAc)4. Obteve-se o produto esperado de inserção com bons rendimentos. A reacção de 5-(4-aminofenil)- 10,15,20-trifenilporfirinatozinco(II) com esse diazo composto na presença de Rh2(OAc)4 mostrou um perfil diferente do da reacção com o outro porfirinato. Foram obtidos três produtos, a saber: produto de bis-inserção e dois outros contendo o grupo funcional amida. Este capítulo descreve ainda a síntese de glicoporfirinas e de glicoclorinas através de reacções de inserção e de ciclopropanação envolvendo, respectivamente, os complexos 5-(4-hidroxifenil)- 10,15,20-trifenilporfirinatozinco(II) e 5,10,15,20- tetraquis(pentafluorofenil)porfirinatozinco(II) com α-diazoacetatos com substituintes sacarídicos. Foram usados, como catalisadores, Rh2(OAc)4 e CuCl, respectivamente, na reacção de inserção e na de ciclopropanação. Tendo em vista a sua aplicação em PDT, os novos produtos foram descomplexados e a unidade glicosídica foi desprotegida. Estudos de geração de oxigénio singuleto mostraram que os compostos obtidos são bons geradores dessa espécie citotóxica. Foram também realizados estudos de avaliação da actividade fotodinâmica em células humanas tumorais HeLa e em células humanas saudáveis HaCaT. Estudos de viabilidade celular, após tratamento fotodinâmico, mostraram que as glicoclorinas são mais eficazes na fotoinactivação das células tumorais. Apenas o derivado da clorina com a unidade de galactose mostrou selectividade para a linha celular tumoral, inibindo o crescimento desta e não causando efeito significativo na linha celular saudável. Este fotossensibilizador não foi tóxico na ausência de luz e depois do tratamento fotodinâmico e em condições sub-letais, provocou vacuolização citoplasmática e retracção pronunciada nas células tumorais, enquanto que nas células saudáveis os danos sofridos foram escassos. Nos estudos de localização celular este fotossensibilizador localizou-se na membrana citoplasmática e nos lisossomas tanto nas células HeLa como nas HaCaT. Na terceira parte deste trabalho são descritos os resultados obtidos nos estudos de funcionalização de porfirinas através da reacção de Suzuki-Miyaura. O complexo 2-(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-5,10,15,20- tetrafenilporfirinatozinco(II) foi o composto escolhido como reagente de partida. Usando a reacção de Suzuki foi possível sintetizar complexos β-bromoarilporfirínicos em bons rendimentos. Estes complexos foram sujeitos à reacção de Suzuki com pinacolborano, tendo sido possível obter os produtos de acoplamento esperados e ainda derivados diméricos de complexos porfirínicos ligados por unidades fenileno. Esta metodologia reacional, catalisada por paládio, permitiu ainda sintetizar novos derivados quinolona-porfirina através da reacção do complexo porfirínico β-borilado anteriormente referido com bromo-quinolonas Nsubstiuídas com grupos alquílicos e glicosídicos. Deste modo foram obtidos derivados quinolona-porfirina em bons rendimentos. Com vista a realizar estudos de potencial aplicação em PACT, foram hidrolisados os grupos éster da unidade de quinolona e clivados os grupos protectores das unidades glicosídicas desses derivados. No estudo por MS Tandem (MS/MS) foi possível verificar que os isómeros dos derivados quinolona-porfirina sofrem as mesmas vias de fragmentação, confirmando as suas estruturas análogas. Foi possível ainda distinguir os derivados em que a unidade de porfirina está ligada à quinolona através da posição C-6 da quinolona daqueles em que a unidade de porfirina está ligada à quinolona através da sua posição C-7. Os estudos de geração de oxigénio singuleto mostraram que as porfirinas β- substituídas com unidades de quinolona são melhores geradoras desta espécie citotóxica do que a tetrafenilporfirina e que a eficiência que têm em gerar essa espécie é afectada pela posição da ligação entre a porfirina e a quinolona, assim como com o tipo do N-substituinte da quinolona. As bases livres dos conjugados quinolona-porfirinatos foram testadas como fotossensibilizadores em PACT em células do parasita Leishmania Braziliensis, tendo-se observado que estes compostos têm capacidade para fotoinactivar este parasita. Na quarta parte deste trabalho são descritos os resultados dos estudos de funcionalização de porfirinas através da reacção de metátese com catalisador de Grubbs, visando a obtenção de novos macrociclos com grupos triazolilo. Verificouse que a eficiência da reacção de metátese cruzada entre 2-vinil-5,10,15,20- tetrafenilporfirinatozinco(II) e 4-vinil-1,2,3-triazóis N-substituídos dependia das condições reaccionais e do triazol usado em cada caso. Foi possível ainda concluir que o impedimento estéreo das espécies envolvidas é um dos responsáveis pelo ciclo catalítico prosseguir por uma via secundária, originando uma espécie de ruténio pouco eficiente como catalisador. Este estudo foi estendido à reacção dos 4-vinil-1,2,3-triazois seleccionados com 2-butadienil-5,10,15,20- tetrafenilporfirinatoniquel(II); em cada caso foi possível obter uma mistura de isómeros dos derivados triazol-porfirina, geralmente em maiores rendimentos globais do que na reacção com 2-vinil-5,10,15,20-tetrafenilporfirinatozinco(II). Este facto será indicativo de que a reacção de metátase com esse derivado porfirínico segue, predominantemente, a via mais eficiente.

Chemical characterization and evaluation of biological activity of Cynara cardunculus extractable compounds

The Mediterranean species Cynara cardunculus L. is recognized in the traditional medicine, for their hepatoprotective and choleretic effects. Biomass of C. cardunculus L. var. altilis (DC), or cultivated cardoon, may be explored not only for the production of energy and pulp fibers, but also for the extraction of bioactive compounds. The chemical characterization of extractable components, namely terpenic and phenolic compounds, may valorize the cultivated cardoon plantation, due to their antioxidant, antitumoral and antimicrobial activities. In this study, the chemical composition of lipophilic and phenolic fractions of C. cardunculus L. var. altilis (DC), cultivated in the south of Portugal (Baixo Alentejo region) was characterized in detail, intending the integral valorization of its biomass. The biological activity of cultivated cardoon extracts was evaluated in terms of antioxidant, human tumor cell antiproliferative and antibacterial effects. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was used for the chemical analysis of lipophilic compounds. Sixty-five lipophilic compounds were identified, from which 1 sesquiterpene lactone and 4 pentacyclic triterpenes were described, for the first time, as cultivated cardoon components, such as: deacylcynaropicrin, acetates of β- and α-amyrin, lupenyl acetate and ψ-taraxasteryl acetate. Sesquiterpene lactones were the major family of lipophilic components of leaves (≈94.5 g/kg), mostly represented by cynaropicrin (≈87.4 g/kg). Pentacyclic triterpenes were also detected, in considerably high contents, in the remaining parts of cultivated cardoon, especially in the florets (≈27.5 g/kg). Taraxasteryl acetate was the main pentacyclic triterpene (≈8.9 g/kg in florets). High pressure liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) was utilized for the chemical analysis of phenolic compounds. Among the identified 28 phenolic compounds, eriodictyol hexoside was reported for the first time as C. cardunculus L. component, and 6 as cultivated cardoon components, namely 1,4-di-O-caffeoylquinic acid, naringenin 7-O-glucoside, naringenin rutinoside, naringenin, luteolin acetylhexoside and apigenin acetylhexoside. The highest content of the identified phenolic compounds was observed in the florets (≈12.6 g/kg). Stalks outer part contained the highest hydroxycinnamic acids abundance (≈10.3 g/kg), and florets presented the highest flavonoids content (≈10.3 g/kg). The antioxidant activity of phenolic fraction was examined through 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay. Stalks outer part, and receptacles and bracts extracts demonstrated the highest antioxidant effect on DPPH (IC50 of 34.35 μg/mL and 35.25 μg/mL, respectively). (cont.) abstract (cont.) The DPPH scavenging effect was linearly correlated with the total contents of hydroxycinnamic acids (r = -0.990). The in vitro antiproliferative activity of cultivated cardoon lipophilic and phenolic extracts was evaluated on a human tumor cells line of triple-negative breast cancer (MDA-MB-231), one of the most refractory human cancers to conventional therapeutics. After 48 h of exposition, leaves lipophilic extract showed higher inhibitory effect (IC50 = 10.39 μg/mL) than florets lipophilic extract (IC50 = 315.22 μg/mL), upon MDA-MB-231 cellular viability. Pure compound of cynaropicrin, representative of the main compound identified in leaves lipophilic extract, also prevented the cell proliferation of MDA-MB-231 (IC50 = 17.86 μM). MDA-MB-231 cells were much more resistant to the 48 h- treatment with phenolic extracts of stalks outer part (IC50 = 3341.20 μg/mL) and florets (IC50 > 4500 μg/mL), and also with the pure compound of 1,5-di-O-caffeoylquinic acid (IC50 = 1741.69 μM). MDA-MB-231 cells were exposed, for 48 h, to the respective IC50 concentrations of leaves lipophilic extract and pure compound of cynaropicrin, in order to understand their ability in modelling cellular responses, and consequently important potentially signaling pathways for the cellular viability decrease. Leaves lipophilic extract increased the caspase-3 enzymatic activity, contrarily to pure compound of cynaropicrin. Additionally, leaves lipophilic extract and pure compound of cynaropicrin caused G2 cell cycle arrest, possibly by upregulating the p21Waf1/Cip1 and the accumulation of phospho-Tyr15-CDK1 and cyclin B1. The inhibitory effects of leaves lipophilic extract and cynaropicrin pure compound, against the MDA-MB-231 cell proliferation, may also be related to the downregulation of phospho-Ser473-Akt. The antibacterial activity of cultivated cardoon lipophilic and phenolic extracts was assessed, for the first time, on two multidrug-resistant bacteria, such as the Gram-negative Pseudomonas aeruginosa PAO1 and the Gram-positive methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), two of the main bacteria responsible for health care-associated infections. Accordingly, the minimum inhibitory concentrations (MIC) were determined. Lipophilic and phenolic extracts of florets did not have antibacterial activity on P. aeruginosa PAO1 and MRSA (MIC > 2048 μg/mL). Leaves lipophilic extract did not prevent the P. aeruginosa PAO1 growth, but pure compound of cynaropicrin was slightly active (MIC = 2048 μg/mL). Leaves lipophilic extract and pure compound of cynaropicrin blocked MRSA growth (MIC of 1024 and 256 μg/mL, respectively). The scientific knowledge revealed in this thesis, either by the chemical viewpoint, or by the biological viewpoint, contributes for the valorization of C. cardunculus L. var. altilis (DC) biomass. Cultivated cardoon has potential to be exploited as source of bioactive compounds, in conciliation with other valorization pathways, and Portuguese traditional cheeses manufacturing.