Avaliação do papel dos polimorfismos em enzimas metabolizadoras e enzimas transportadoras de fármacos em neoplasias hematológicas

O cancro é um dos maiores causadores globais de mortalidade e morbilidade, ocorrendo cerca de 14 milhões de novos casos por ano e 8,2 milhões de mortes anuais com esta patologia, números que tendem a aumentar 70% nas próximas duas décadas. A característica tumoral mais nefasta é a sua capacidade de metastização para outros órgãos, um mecanismo que pode ser despoletado pela falha dos mecanismos normais de controlo de crescimento, proliferação e reparação celulares, que facilita o processo de transformação de células normais em células cancerígenas. A oncogénese processa-se em três etapas, a iniciação, a promoção e a progressão e pode ter origem em células estaminais cancerígenas, que regulam as capacidades de propagação e recidiva do tumor. As neoplasias hematológicas resultam de alterações genéticas e /ou epigenéticas que conduzem à desregulação da proliferação, ao bloqueio da diferenciação e/ou à resitência à apoptose. Para além dos fatores de risco exógenos, como agentes carcinogénicos físicos, químicos e biológicos, existem também fatores endógenos, incluindo características genéticas, que podem alterar a predisposição para o aparecimento de neoplasias, bem como influenciar a resposta à terapêutica. Uma das terapêuticas aplicadas no tratamento do cancro é a quimioterapia. Os fármacos administrados a doentes oncológicos seguem normalmente o percurso de absorção, distribuição, metabolização e eliminação. Este curso pode sofrer alterações caso as proteínas transportadoras e metabolizadoras necessárias não atuem corretamente. Para um melhor conhecimento da influência das alterações provocadas por variações nos genes que codificam proteínas transportadoras de efluxo (MDR1, MRP1), proteínas de influxo (OCTN2) e proteínas metabolizadoras (UCK2), o objetivo deste trabalho consistiu na avaliação de polimorfismos nos genes MDR1, MRP1, OCTN2 e UCK2 e da sua relação com a predisposição para o desenvolvimento de neoplasias hematológicas. Para isto, foram utilizadas amostras de 307 doentes com neoplasias hematológicas, 83 de Síndrome Mielodisplásica (SMD), 63 Leucemia Mieloide Aguda (LMA), 16 de Síndrome Mielodisplásica/Neoplasias Mieloproliferativas (SMD/NMP), 77 de Mieloma Múltiplo (MM) e 68 de Gamapatia Monoclonal de Significado Indeterminado (MGUS) e 164 de controlos não neoplásicos e/ou indivíduos saudáveis. As amostras de ADN foram extraídas do sangue periférico com protocolo adequado. De forma a determinar os genótipos correspondentes a cada amostra, realizaram-se técnicas de RFLP-PCR e ARMS-PCR. Posteriormente, calcularam-se estatisticamente as frequências alélicas e genotípicas relativas às variantes polimórficas dos genes MDR1, MRP1, OCTN2 e UCK2 e verificou-se se estavam em Equilíbrio de Hardy-Weinberg. De seguida, avaliou-se a força de associação entre as formas polimórficas e o risco de desenvolvimento de neoplasias hematológicas, através do cálculo do risco relativo por análise de regressão logística. Avaliaram-se ainda os perfis genéticos e a possível relação com o desenvolvimento e progressão da neoplasia com recurso a regressão logística e análise de Kaplan-Meier. De um modo geral as frequências alélicas e genotípicas não se revelaram alteradas comparativamente ao esperado. A análise do odds ratio associado ao polimorfismo rs1045642 do gene MDR1 revelou que o genótipo CT pode constituir um fator de risco aumentado de 1,84x para o desenvolvimento de Gamapatias Monoclonais e 2,27x para o desenvolvimento de Mieloma Múltiplo. Por outro lado, a presença de genótipos portadores do alelo T têm um efeito protetor no desenvolvimento de MM (OR=0,41). O cálculo do risco associado ao polimorfismo rs4148330 do gene MRP1 revela que o genótipo AG é um fator protetor (OR=0,50) para o desenvolvimento de LMA, assim como o alelo G (OR=0,50). Além disso, verificámos que existe uma associação de risco de desenvolver neoplasia com o polimorfismo rs2185268 do gene UCK2. De facto, a presença dos genótipos CC e AC representam um fator de risco 4,59x aumentado para o desenvolvimento de SMD/NMP. O polimorfismo rs274561 do gene OCTN2 não apresenta relação com o risco relativo de desenvolvimento neoplásico. Da avaliação da influência dos polimorfismos em estudo na sobrevivência global dos doentes, podemos assumir que a presença do genótipo GG relativo ao polimorfismo rs2185268 do gene UCK2 representa uma diminuição da sobrevivência em 11 meses. Os resultados obtidos a partir do nosso estudo permitem-nos concluir que os polimorfismos podem ser fatores relevantes na predisposição para o desenvolvimento de neoplasias hematológicas e na progressão destas doenças.

Impact of exercise training on cancer-induced cardiac dysfunction

Cachexia is a complex syndrome characterized by severe weight loss frequently observed in cancer patients and associated with poor prognosis. Cancer cachexia is also related to modifications in cardiac muscle structure and metabolism leading to cardiac dysfunction. In order to better understand the cardiac remodeling induced by bladder cancer and the impact of exercise training after diagnosis on its regulation, we used an animal model of bladder cancer induced by exposition to N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (BBN) in the drinking water. Healthy animals and previously BBN exposed animals were submitted to a training program in a treadmill at a speed of 20m/min, 60 min/day, 5 days/week during 13 weeks. At the end of the protocol, animals exposed to BBN presented a significant decrease of body weight, in comparison with control groups, supporting the presence of cancer cachexia. Morphological analysis of the cardiac muscle sections revealed the presence of fibrosis and a significant decrease of cardiomyocyte’s cross-sectional area, suggesting the occurrence of cardiac dysfunction associated with bladder cancer. These modifications were accompanied by heart metabolic remodeling characterized by a decreased fatty acid oxidation given by diminished levels of ETFDH and of complex II subunit  from the respiratory chain. Exercise training promoted an increment of connexin 43, a protein involved in cardioprotection, and of c-kit, a protein present in cardiac stem cells. These results suggest an improved heart regenerative capacity induced by exercise training. In conclusion, endurance training seems an attractive non-pharmacological therapeutic option for the management of cardiac dysfunction in cancer cachexia.

Protein phosphatases acting on the replication checkpoint

A génese de um cancro está dependente da acumulação de mutações genéticas que dão origem a instabilidade genómica, que por sua vez resulta na proliferação descontrolada. Para prevenir a acumulação destas mutações, as células têm mecanismos de controlo (checkpoints) que suspendem o ciclo celular e accionam as vias de reparação do ADN. Estes eventos são muitas vezes regulados por dinâmicas de (des)fosforilação de proteínas. As proteínas fosfatases (PPs), enzimas responsáveis pela remoção do grupo fosfato de resíduos fosforilados, desempenham funções cruciais na regulação de muitos mecanismos celulares. Enquanto que no início do projecto as cinases envolvidas no checkpoint da replicação estavam bem estabelecidas, as PPs envolvidas não eram conhecidas. A Chk1, um componente da maquinaria do checkpoint da replicação, é exemplo dessa regulação por (des)fosforilação, como sejam nos resíduos Ser317 e Ser345. Assim, como primeira abordagem para determinar quais os grupos de PPs envolvidos na regulação do checkpoint da replicação, decidimos investigar o seu papel na regulação da fosforilação da Chk1. A primeira conclusão é que a desfosforilação da Chk1 ao longo do tempo, tanto in vivo como in vitro, ocorre com uma dinâmica bi-fásica. Em segundo, a abordagem in vitro sugere que as famílias PP1, PP2A e PP2C estão envolvidas na desfosforilação da Chk1. Uma vez que a família PP2A foi a que mostrou a maior acção nesta reacção, decidimos investigar outros membros da família in vivo, primeiro com uma abordagem geral (tratando com OA ou sobreexpressando a PME-1), e depois com o knockdown específico da PP4 e PP6 (através de siRNA). Os resultados mostram que a inibição das PPs afectam tanto a desfosforilação como o estado de activação da Chk1 em resposta a tratamento com Hidroxiureia (HU). Todas as PPs testadas in vivo pareceram ser capazes de regular, a níveis diferentes, tanto a fosforilação como a desfosforilação da Chk1. A função das PPs foi também investigada ao nível: da regulação do disparo das origens de replicação, e da recuperação da suspensão da replicação, induzida pela HU. No último caso, os dados indicam que na situação simultânea de knockdown da PP4 com tratamento de HU, há um atraso do ciclo celular na resolução da transição de G2/M. No ensaio de replicação por pulse-chase, os resultamos mostram que tanto o tratamento com OA, como a sobre-expressão de I-2 ou PME-1, atrasam a cronologia do disparo programado das origens de replicação. No entanto, nenhum dos tratamentos efectuados parece desregular o início do checkpoint da replicação. Um rastreio de 2-híbrido de levedura com uma biblioteca de cDNA de testículo humano foi realizado, usando a Chk1 como isco, no sentido de descobrir novos interactores e definir novas possíveis funções para a Chk1 no contexto da meiose. Com base nos resultados do rastreio, duas novas funções são sugeridas: a interacção com a GAGE12 sugere uma função na recombinação genómica/vigilância do genoma durante a meiose, e as interacções com a EEF1α1 e a RPS5 sugerem uma função na regulação da síntese proteíca. Estas experiências fornecem um visão geral para a compreensão da diversidade de funções das proteínas fosfatases envolvidas no checkpoint da replicação, bem como, abre novos caminhos para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento do cancro.

Lipidomic analysis of mesenchymal cells candidates for cell therapy

Mesenchymal stromal cells are adult stem cells found mostly in the bone marrow. They have immunosuppressive properties and they have been successfully applied as biological therapy in several clinical trials regarding autoimmune diseases. Despite the great number of clinical trials, MSCs’ action is not fully understand and there are no identified markers that correlate themselves with the immunomodulatory power. A lipidomic approach can solve some of these problems once lipids are one of the major cells’ components. Therefore, in this study cells’ lipidome was analysed and its deviations were evaluated according to the medium of culture and to the presence of pro-inflammatory stimuli, mimicking physiological conditions in which these cells are used. This was the first study ever made that aimed to analyse the differences in the phospholipid profile between mesenchymal stromal cells non-stimulated and stimulated with proinflammatory stimulus. This analysis was conducted in both cells cultured in medium supplemented with animal serum and in cells cultured in a synthetic medium. In cells cultured in the standard medium the levels of phosphatidylcholine (PC) species with shorter fatty acids (FAs) acyl chains decreased under pro-inflammatory stimuli. The level of PC(40:6) also decreased, which may be correlated with enhanced levels of lysoPC (LPC)(18:0) - an anti-inflammatory LPC - observed in cells subjected to TNF-α and IFN-γ. Simultaneously, the relative amounts of PC(36:1) and PC(38:4) increased. TNF-α and IFN- γ also enhanced the levels of phosphatidylethanolamine PE(40:6) and decreased the levels of PE(38:6). Higher expression of phosphatidylserine PS(36:1) and sphingomyelin SM(34:0) along with a decrease in PS(38:6) levels were observed. However, in cells cultured in a synthetic medium, TNF-α and IFN-γ only enhanced the levels of PS(36:1). These results indicate that lipid metabolism and signaling is modulated during mesenchymal stromal cells action.