Evaluation of the matabolic response of osteosarcoma cells to conventional and new anticancer drugs by NMR metabolomics

The main scope of this work was to evaluate the metabolic effects of anticancer agents (three conventional and one new) in osteosarcoma (OS) cells and osteoblasts, by measuring alterations in the metabolic profile of cells by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy metabolomics. Chapter 1 gives a theoretical framework of this work, beginning with the main metabolic characteristics that globally describe cancer as well as the families and mechanisms of action of drugs used in chemotherapy. The drugs used nowadays to treat OS are also presented, together with the Palladium(II) complex with spermine, Pd2Spm, potentially active against cancer. Then, the global strategy for cell metabolomics is explained and the state of the art of metabolomic studies that analyze the effect of anticancer agents in cells is presented. In Chapter 2, the fundamentals of the analytical techniques used in this work, namely for biological assays, NMR spectroscopy and multivariate and statistical analysis of the results are described. A detailed description of the experimental procedures adopted throughout this work is given in Chapter 3. The biological and analytical reproducibility of the metabolic profile of MG-63 cells by high resolution magic angle spinning (HRMAS) NMR is evaluated in Chapter 4. The metabolic impact of several factors (cellular integrity, spinning rate, temperature, time and acquisition parameters) on the 1H HRMAS NMR spectral profile and quality is analysed, enabling the definition of the best acquisition parameters for further experiments. The metabolic consequences of increasing number of passages in MG-63 cells as well as the duration of storage are also investigated. Chapter 5 describes the metabolic impact of drugs conventionally used in OS chemotherapy, through NMR metabolomics studies of lysed cells and aqueous extracts analysis. The results show that MG-63 cells treated with cisplatin (cDDP) undergo a strong up-regulation of lipid contents, alterations in phospholipid constituents (choline compounds) and biomarkers of DNA degradation, all associated with cell death by apoptosis. Cells exposed to doxorubicin (DOX) or methotrexate (MTX) showed much slighter metabolic changes, without any relevant alteration in lipid contents. However, metabolic changes associated with altered Krebs cycle, oxidative stress and nucleotides metabolism were detected and were tentatively interpreted at the light of the known mechanisms of action of these drugs. The metabolic impact of the exposure of MG-63 cells and osteoblasts to cDDP and the Pd2Spm complex is described in Chapter 6. Results show that, despite the ability of the two agents to bind DNA, the metabolic consequences that arise from exposure to them are distinct, namely in what concerns to variation in lipid contents (absent for Pd2Spm). Apoptosis detection assays showed that, differently from what was seen for MG-63 cells treated with cDDP, the decreased number of living cells upon exposure to Pd2Spm was not due to cell death by apoptosis or necrosis. Moreover, the latter agent induces more marked alterations in osteoblasts than in cancer cells, while the opposite seemed to occur upon cDDP exposure. Nevertheless, the results from MG-63 cells exposure to combination regimens with cDDP- or Pd2Spm-based cocktails, described in Chapter 7, revealed that, in combination, the two agents induce similar metabolic responses, arising from synergy mechanisms between the tested drugs. Finally, the main conclusions of this thesis are summarized in Chapter 8, and future perspectives in the light of this work are presented.

Comunidades de prática online: contributos para a prática letiva: um estudo de caso no âmbito da educação em ciência envolvendo professores e investigadores

As comunidades de prática (CoP), bem como a investigação-ação, têm vindo a ser apontadas na literatura como formas de promover o desenvolvimento profissional de professores, potenciando a melhoria das suas práticas letivas. Contudo, as evidências empíricas relativas às práticas letivas desenvolvidas por professores no âmbito dessas configurações sociais são escassas. Neste estudo procura-se contribuir para colmatar essa lacuna ao analisar uma CoP online, que envolveu professores de ciências e investigadores em Educação em Ciência (EC) e se constituiu no âmbito do projeto “Investigação e práticas lectivas em Educação em Ciência: Dinâmicas de interacção” (IPEC), com enfoques distintos, a que se alude abaixo. A investigação realizada envolveu uma metodologia de natureza predominantemente qualitativa, descritiva, exploratória e do tipo estudo de caso único, sendo o caso as práticas letivas desenvolvidas pelos membros da CoP referida e as dinâmicas de interação entre os mesmos. Como técnicas de recolha de dados, recorreu-se principalmente à observação mediada pela plataforma online de apoio ao desenvolvimento do projeto (dados estatísticos e as mensagens registadas automaticamente) e recolha de documentos. Quanto às técnicas de análise de dados, optou-se principalmente pela análise de conteúdo e análise documental interna, tendo-se triangulado dados de diferentes fontes. Com base no Interconnected Model of Teacher Professional Growth, que Clarke e Hollingsworth propuseram em 2002, e em instrumentos de análise resultantes da revisão de literatura, adaptados aos enfoques definidos, a análise da CoP selecionada incidiu sobre: a) os domínios externo e das práticas de desenvolvimento curricular (DC), ou seja, as suas dinâmicas de interação durante dois anos letivos; b) o domínio das consequências nas práticas letivas, no que concerne às estratégias de ensino de ciências desenvolvidas; c) a evidências do seu carater inovador; e d) aos princípios de DC operacionalizados através do módulo curricular desenhado, implementado, avaliado e disseminado pelos membros da CoP. Os resultados indicam que a) a participação dos membros variou ao longo do período de interação e que a sua dinâmica se enquadra numa adaptação das fases de desenvolvimento de CoP proposta por Wenger e colegas em 2002, com dois ciclos de investigação-ação; b) a CoP desenvolveu estratégias de ensino diversificadas, pouco exploradas por professores e coerentes com diversas recomendações da literatura, de forma consistente; c) as práticas letivas são inovadoras, do tipo challenging, tendo incluído o envolvimento de professores que lecionavam nas escolas dos professores membros da CoP; e d) a CoP operacionalizou vários princípios de DC recomendados na literatura, nomeadamente a flexibilidade e diferenciação. Os resultados empíricos permitiram ainda validar as dimensões do modelo de Clarke e Hollingsworth, assim como adaptar à especificidade do caso analisado.Pelo acima referido, embora reconhecendo as limitações do estudo, nomeadamente relativas às opções metodológicas efetuadas, foi possível inferir que o trabalho realizado no seio desta CoP online de professores e investigadores contribuiu para a inovação e melhoria de práticas letivas de EC. Do estudo resultam ainda instrumentos de análise que se consideram relevantes, dado poderem vir a ser usados em investigações futuras, assim como poderem vir a orientar professores de ciências que desejem alinhar as suas práticas de ensino com recomendações da investigação em EC. Por fim, são apresentadas recomendações relativamente ao envolvimento de professores e investigadores em CoP online, no âmbito da EC, assim como relativamente a possibilidades ao nível de investigações futuras, nomeadamente a validação dos instrumentos e das recomendações apresentadas em contextos mais abrangentes e transversais.

Effect of photodynamic therapy on the virulence factors of Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus are Gram-positive bacteria who integrate the human microbiota. Nevertheless, these bacteria can be pathogenic to the humans. Due to the increasing occurrence of antibiotic-resistant S. aureus new approaches to control this pathogen are necessary. The antimicrobial photodynamic inactivation process (PDI) is based in the combined use of a light source, an oxidizing agent like oxygen and an intermediary agent (a photosensitizer). These three components interact to form cytotoxic reactive oxygen species that irreversibly damage vital constituents of the microbial cells and ultimately lead to cell death. In fact, PDI is being shown to be a promising alternative to the antibiotic approach in the inactivation of pathogenic microorganisms. However, information on effects of photosensitization on particular virulence factors is strikingly scarce. The objective of this work was to evaluate the effect of PDI on virulence factors of S. aureus. For this, as photosensitizer the 5,10,15,20-tetrakis(1-methylpyridinium-4-yl)porphyrin tetra-iodide (Tetra-Py+-Me) and six strains of S. aureus (one reference strain, one strain with 1 enterotoxin, two strains with 3 enterotoxins and two strains resistant to methicillin, MRSA – one with 5 enterotoxins and the other without enterotoxins) were used. The effect of photosensitization on catalase activity, beta hemolysis, lipases, thermonuclease, enterotoxins, coagulase production and resistance to methicillin was assessed. The results indicate that the expression of some virulence factors in the cells subjected to this therapy is affected. Additionally the susceptibility of the strains to PDI did not decrease upon successive treatments.