Regulation of single exocytotic events by the cAMP signaling pathway

Permanece por esclarecer como a via de sinalização do cAMP modula a exocitose regulada. Os principais objetivos deste trabalho foram: i) avaliar o efeito do cAMP nos eventos exocitóticos, nas propriedades dos poros de fusão e na secreção hormonal; ii) perceber o impacto da sinalização por cAMP-HCN na exocitose e nas propriedades do poro de fusão; e iii) estudar as propriedades do poro de fusão na presença de um agente neurotóxico comum, como o alumínio. Lactotrofos, isolados a partir da hipófise anterior de ratos Wistar machos, foram usados como modelo celular. Os eventos unitários de fusão exocitótica e a prolactina (PRL) libertada foram avaliados, respetivamente, em ensaios eletrofisiológicos efectuados segundo a técnica de contacto hermético no modo sobre a célula aderida à pipeta porta-elétrodo e com recurso a métodos imunológicos de deteção. Os níveis intracelulares de cAMP foram aumentados por 3-isobutil-1-metilxantina (IMBX), forscolina e N6,2'-O-dibutiril adenosina- 3',5'-monofosfato cíclico (dbcAMP). A expressão dos canais HCN foi determinada por Western-blot, qRT-PCR e imunocitoquímica em combinação com microscopia confocal. Culturas primárias de lactotrofos foram também transfetadas com DNA plasmídico que codifica HCN2 juntamente com a proteína-verde-fluorescente e um agente farmacológico foi usado para avaliar o efeito de cAMP-HCN na exocitose. Observou-se que os lactotrofos responderam à forscolina e ao dbcAMP libertando PRL de um modo bifásico e dependente da concentração, uma vez que a secreção aumentou e diminuiu, respectivamente, na gama de baixas e altas concentrações. Os compostos que elevaram os níveis de cAMP aumentaram os eventos transientes e impediram a fusão completa. Além disso, o dbcAMP promoveu o aparecimento de eventos exocitóticos transientes de elevada periodicidade, cujos poros de fusão, de maior diâmetro, se mativeram abertos durante mais tempo. A expressão das quatro isoformas de HCN foi confirmada nos lactotrofos ao nível do mRNA e, tal como no coração, rim e hipófise, o mais abundante codifica a isoforma HCN2. Nos lactotrofos com sobre-expressão desta isoforma, o dbcAMP não só aumentou a frequência dos eventos transientes e a condutância dos poros, mas também a frequência dos eventos de fusão completa. Enquanto o bloqueador dos canais HCN, ZD7288, reduziu a frequência dos eventos transientes e de fusão completa desencadeados por dbcAMP e diminuiu o diâmetro dos poros de fusão. A simultânea diminuição da libertação de PRL, da frequência dos eventos transientes e do diâmetro dos poros de fusão representaram as principais alterações observados após pré-tratamento dos lactotrofos com concentração micromolar de alumínio. Em conclusão, os resultados demonstram que elevados níveis de cAMP reduzem a secreção de PRL devido à estabilização dos poros de fusão no estado de maior abertura. Além disso, a via de sinalização cAMP-HCN afecta a actividade exocitótica e modifica as propriedades dos poros de fusão, que parecem ser igualmente importantes na citotoxicidade induzida por alumínio.

Extension of electrochemically active sites in SOFCs and SOECs

Solid oxide fuel (SOFCs) and electrolyzer (SOECs) cells have been promoted as promising technologies for the stabilization of fuel supply and usage in future green energy systems. SOFCs are devices that produce electricity by the oxidation of hydrogen or hydrocarbon fuels with high efficiency. Conversely, SOECs can offer the reverse reaction, where synthetic fuels can be generated by the input of renewable electricity. Due to this similar but inverse nature of SOFCs and SOECs, these devices have traditionally been constructed from comparable materials. Nonetheless, several limitations have hindered the entry of SOFCs and SOECs into the marketplace. One of the most debilitating is associated with chemical interreactions between cell components that can lead to poor longevities at high working temperatures and/or depleted electrochemcial performance. Normally such interreactions are countered by the introduction of thin, purely ionic conducting, buffer layers between the electrode and electrolyte interface. The objective of this thesis is to assess if possible improvements in electrode kinetics can also be obtained by modifying the transport properties of these buffer layers by the introduction of multivalent cations. The introduction of minor electronic conductivity in the surface of the electrolyte material has previously been shown to radically enhance the electrochemically active area for oxygen exchange, reducing polarization resistance losses. Hence, the current thesis aims to extend this knowledge to tailor a bi-functional buffer layer that can prevent chemical interreaction while also enhancing electrode kinetics.The thesis selects a typical scenario of an yttria stabilized zirconia electrolyte combined with a lanthanide containing oxygen electrode. Gadolinium, terbium and praseodymium doped cerium oxide materials have been investigated as potential buffer layers. The mixed ionic electronic conducting (MIEC) properties of the doped-cerium materials have been analyzed and collated. A detailed analysis is further presented of the impact of the buffer layers on the kinetics of the oxygen electrode in SOFC and SOEC devices. Special focus is made to assess for potential links between the transport properties of the buffer layer and subsequent electrode performance. The work also evaluates the electrochemical performance of different K2NiF4 structure cathodes deposited onto a peak performing Pr doped-cerium buffer layer, the influence of buffer layer thickness and the Pr content of the ceria buffer layer. It is shown that dramatic increases in electrode performance can be obtained by the introduction of MIEC buffer layers, where the best performances are shown to be offered by buffer layers of highest ambipolar conductivity. These buffer layers are also shown to continue to offer the bifunctional role to protect from unwanted chemical interactions at the electrode/electrolyte interface.

Biotecnologia: concepção e validação de trabalhos práticos

É hoje geralmente aceite que a educação em ciências, além da aprendizagem de conhecimento conceptual e procedimental, deve promover nos alunos o desenvolvimento de competências investigativas, ou seja, competências para identificar, formular e resolver problemas. Porém, o desenvolvimento de actividades práticas de natureza investigativa é difícil, pela carência, ou mesmo ausência, de vivências dos professores em investigações, sobretudo em projectos aplicáveis nas práticas lectivas. A frequente falta de formação inicial e contínua dos professores de ciências, relativamente ao desenvolvimento de competências indispensáveis à implementação desta perspectiva de trabalho prático, constitui um obstáculo à concretização de inovações educativas preconizadas para a educação em ciências, referidas em documentos aprovados e publicados pelo Ministério da Educação, em particular, orientações curriculares e programas disciplinares. A abordagem de temáticas em biotecnologia configura-se como uma necessidade das sociedades actuais, de modo que, atendendo aos avanços que se têm vindo a verificar nesta área, deverá integrar-se em educação científica formal, relacionando-a com a vida quotidiana dos cidadãos. Além de componentes científicas inovadoras, os seus desenvolvimentos têm diversas implicações, designadamente éticas, políticas, económicas e sociais. A investigação apresentada nesta dissertação insere-se neste quadro, a qual se baseou no seguinte problema: “Partindo de temáticas em biotecnologia, como estimular o desenvolvimento de trabalho prático numa perspectiva investigativa por professores de Biologia e/ou Geologia?”. Definiram-se dois objectivos gerais: 1) testar, conceber e optimizar actividades laboratoriais e experimentais em biotecnologia, transponíveis para contextos educativos dos ensinos básico e secundário, desmistificando a complexidade associada ao trabalho prático nesta área; 2) conceber, implementar e avaliar uma acção de formação para professores de Biologia e/ou Geologia, na modalidade de Oficina de Formação, visando em contextos escolares e em temáticas de biotecnologia, desenvolver percursos investigativos. A acção de formação “Desenvolvimento de actividades práticas em biotecnologia numa perspectiva investigativa: um contributo na (re)orientação de ensino e aprendizagem de ciências” estimulou os professores-formandos a participarem activamente num programa que integrava abordagens inovadoras de trabalho prático, e criou condições para, com orientação e apoio, desenvolverem percursos investigativos a partir de situações-problema em temáticas de biotecnologia. Na generalidade, as reflexões dos professores-formandos sobre os percursos investigativos planeados e implementados, e os ganhos a nível profissional e/ou pessoal, além de referências elogiosas à estrutura e sequência das actividades propostas na formação, realçaram os seguintes aspectos positivos: a) o enriquecimento de conhecimentos científico-tecnológicos em biotecnologia; b) a oportunidade de reflexão sobre as suas práticas e a necessidade de uma nova forma de olhar para o trabalho laboratorial e experimental e para o seu papel nas aulas de ciências; c) as potencialidades de trabalho prático numa perspectiva investigativa em termos de mobilização de competências de natureza conceptual e processual; d) o desenvolvimento de competências técnicas e processuais necessárias à implementação de percursos investigativos com recurso a procedimentos em biotecnologia. Do presente estudo decorrem implicações educacionais que se esperam pertinentes para a formação de professores de ciências e elaboração de recursos didácticos, designadamente manuais escolares, assim como, para a gestão dos programas disciplinares. Este estudo permitiu, ainda, apresentar propostas para futuras investigações.

Perception and software architecture for mobile robotics

When developing software for autonomous mobile robots, one has to inevitably tackle some kind of perception. Moreover, when dealing with agents that possess some level of reasoning for executing their actions, there is the need to model the environment and the robot internal state in a way that it represents the scenario in which the robot operates. Inserted in the ATRI group, part of the IEETA research unit at Aveiro University, this work uses two of the projects of the group as test bed, particularly in the scenario of robotic soccer with real robots. With the main objective of developing algorithms for sensor and information fusion that could be used e ectively on these teams, several state of the art approaches were studied, implemented and adapted to each of the robot types. Within the MSL RoboCup team CAMBADA, the main focus was the perception of ball and obstacles, with the creation of models capable of providing extended information so that the reasoning of the robot can be ever more e ective. To achieve it, several methodologies were analyzed, implemented, compared and improved. Concerning the ball, an analysis of ltering methodologies for stabilization of its position and estimation of its velocity was performed. Also, with the goal keeper in mind, work has been done to provide it with information of aerial balls. As for obstacles, a new de nition of the way they are perceived by the vision and the type of information provided was created, as well as a methodology for identifying which of the obstacles are team mates. Also, a tracking algorithm was developed, which ultimately assigned each of the obstacles a unique identi er. Associated with the improvement of the obstacles perception, a new algorithm of estimating reactive obstacle avoidance was created. In the context of the SPL RoboCup team Portuguese Team, besides the inevitable adaptation of many of the algorithms already developed for sensor and information fusion and considering that it was recently created, the objective was to create a sustainable software architecture that could be the base for future modular development. The software architecture created is based on a series of di erent processes and the means of communication among them. All processes were created or adapted for the new architecture and a base set of roles and behaviors was de ned during this work to achieve a base functional framework. In terms of perception, the main focus was to de ne a projection model and camera pose extraction that could provide information in metric coordinates. The second main objective was to adapt the CAMBADA localization algorithm to work on the NAO robots, considering all the limitations it presents when comparing to the MSL team, especially in terms of computational resources. A set of support tools were developed or improved in order to support the test and development in both teams. In general, the work developed during this thesis improved the performance of the teams during play and also the e ectiveness of the developers team when in development and test phases.