O efeito do stress celular na proteína precursora de amilóide de Alzheimer = The effect of cellular stress on the Alzheimer's amyloid precursor protein

A proteína precursora de amilóide de Alzheimer (APP) é um factor chave na doença de Alzheimer (AD). Essencialmente o processamento da APP resulta na produção de Abeta, o peptídeo tóxico depositado nas placas de amilóide dos indivíduos com AD. Ainda permanece por esclarecer se o processamento da APP é afectado sob condições de stress celular, potencialmente aumentando a quantidade de Abeta produzida. Além disso, o stress celular pode induzir alterações moleculares, associadas à AD, que podem representar marcadores moleculares úteis para o diagnóstico da AD. Com estas questões em mente, procurámos identificar alterações, em resposta ao stress celular, no processamento da APP e na expressão de outras proteínas. Nestes estudos de monitorização considerámos que a fosforilação proteica anormal e o stress oxidativo podem contribuir para a condição patológica. Assim, investigámos o processamento da APP dependente da fosforilação durante o stress celular. Os dados obtidos confirmam que a secreção da APP é reduzida em situações de stress, e que o efeito é idêntico em linhas celulares de tipo neuronal e não neuronal. Os resultados obtidos revelam que o PMA, mesmo em situações de stress (azida de sódio 1 mM) pode afectar o processamento da APP, aumentando a produção de sAPP (o fragmento secretado após o processamento de APP) que pode potencialmente reduzir a produção de Abeta. A hipótese de afectar a produção de Abeta dependente da fosforilação, que por sua vez pode ter relevância num quadro clínico, mantém-se mesmo em condições de stress. Os resultados revelaram que a indução de sAPP, após a adição de ésteres de forbol, ou ácido ocadeíco, em condições de stress não é idêntica. Em contraste, sob condições controlo, tanto os ésteres de forbol como o ácido ocadeíco produzem o mesmo efeito em termos da produção de sAPP. Aparentemente estas duas vias podem ser dissociadas em condições de stress, o que de algum modo pode reflectir processamento alterado da APP em condições adversas. Nas experiências em que se analisou a expressão de outros potenciais marcadores moleculares, foram detectadas alterações nos níveis de expressão de várias proteínas. Estes marcadores moleculares representam alvos interessantes para futura validação e potenciais candidatos para um diagnóstico molecular na AD. As proteínas já identificadas são importantes do ponto de vista da transdução de sinais, e incluem a PP1, a HSP70, a PARP e a própria APP.

Microbiological quality of bivalves: relevance to food safety

Os moluscos bivalves constituem um recurso haliêutico de elevada importância na economia (inter)nacional pelas suas características organolépticas, valor nutritivo e relevância na gastronomia tradicional. Não obstante, representam um produto alimentar de elevado risco para a saúde pública. A contaminação microbiológica (autóctone e antropogénica), sendo crónica nos bancos de bivalves das zonas estuarino-lagunares, constitui uma das principais preocupações associadas à segurança alimentar. Aquando da filtração inerente aos processos de respiração e alimentação, os bivalves bioacumulam passivamente microrganismos incluindo os patogénicos. A sua colocação no mercado impõe pois, prévia salubrização para níveis microbiológicos compatíveis com a legislação em vigor, salvaguardando a saúde pública. Apesar da monitorização das áreas de apanha e produção, das medidas de prevenção e da depuração, a ocorrência de surtos associados ao consumo de bivalves tem aumentado. Tal deve-se à insuficiente monitorização da contaminação microbiológica dos bivalves, contribuindo para uma gestão ineficaz do produto e consequente sub-valorização. O presente trabalho pretendeu caracterizar o estado de desenvolvimento do sector de exploração de bivalves em Portugal do ponto de vista da segurança alimentar, e analisar os aspectos cruciais da monitorização e da depuração do produto apresentando alternativas abrangentes e aplicáveis ao sector. Assim, desenvolveu-se uma metodologia de base molecular passível de adaptação à monitorização dos bivalves das zonas conquícolas, como alternativa ao método de referência vigente do Número Mais Provável que é baseado apenas na quantificação de Escherichia coli. O mexilhão (Mytilus edulis) da Ria de Aveiro, bivalve de interesse comercial a nível (inter)nacional serviu de modelo para a comparação de protocolos de extração de DNA. Esta metodologia foi desenvolvida de modo a que os métodos de extração de DNA sejam passíveis de aplicação a outras matrizes biológicas ou ambientais. Para além da detecção e quantificação directa de bactérias patogénicas, esta metodologia poderá ser aplicada à monitorização da transferência vertical microbiana nos bancos de bivalves bem como à caracterização da dinâmica espacio-temporal das populações microbianas no ambiente e à monitorização dos processos de depuração. Foi ainda abordado o potencial da aplicação de bacteriófagos ou de enzimas líticas para a optimização dos processos de purificação. O trabalho realizado e as perspectivas futuras propostas pretendem contribuir para a dinamização e requalificação do sector de exploração de bivalves através da melhoria do nível de segurança alimentar dos moluscos bivalves comercializados para alimentação humana, valorizando este recurso.

O questionamento no alinhamento do ensino, aprendizagem e avaliação

O questionamento dos alunos é reconhecido como uma capacidade fundamental, de nível superior, associada ao desenvolvimento de outras competências centrais, como o pensamento crítico, a resolução de problemas ou a capacidade de reflexão, assumindo especial relevância no contexto de disciplinas científicas. O presente estudo surge no atual enquadramento de reestruturação curricular do ensino universitário em Portugal, como um caso de colaboração estreita entre investigadores do Departamento de Educação e professores das Unidades Curriculares de “Microbiologia”, “Genética” e “Temas e Laboratórios de Biologia”, do Departamento de Biologia, na Universidade de Aveiro. Estas unidades curriculares, dirigidas a alunos de várias licenciaturas, são sobretudo frequentadas por alunos do primeiro ano das licenciaturas em Biologia e Biologia/Geologia. Um dos principais objetivos era identificar contextos de prática no âmbito dos quais pudéssemos sugerir estratégias inovadoras de Ensino, Aprendizagem e Avaliação (EAA), que promovessem o questionamento dos estudantes, numa lógica de alinhamento construtivo. Outro dos objetivos era também o de analisar e caracterizar o questionamento dos alunos, associado à diversidade de estratégias adotadas. A presente investigação adota princípios dos paradigmas naturalista e sociocrítico, seguindo uma abordagem metodológica sobretudo de natureza qualitativa. As várias situações de EAA foram desenhadas, implementadas e adaptadas atendendo às particularidades de cada Unidade Curricular (UC), ao longo de dois estudos (2007/2008 e 2008/2009). O questionamento dos alunos foi caracterizado nos diversos contextos de EAA, atendendo ao seu nível cognitivo. Realizaram-se entrevistas semiestruturadas com alunos selecionados, no fim de cada estudo (17 alunos no total), e também com os professores envolvidos (4 professores), no fim do segundo estudo. A análise do questionamento dos alunos nos variados contextos, permitiu confirmar um questionamento espontâneo pouco frequente e tendencialmente de baixo nível cognitivo associado à expressão oral. No entanto, em situações com efeitos sumativos na avaliação, verificou-se um maior envolvimento e uma maior participação dos alunos, associados a uma maior frequência e qualidade do questionamento. Confirmamos o papel fundamental que a avaliação desempenha no decurso da aprendizagem, valorizando o seu papel formativo bem como o feedback proporcionado pelos professores no sentido de alcançar melhores desempenhos em termos de questionamento e, em última análise, em termos de aprendizagem. Todas as evidências recolhidas permitem afirmar que o questionamento constituiu um importante motor para um alinhamento construtivo entre o ensino, a aprendizagem e a avaliação, devidamente articulados com os objetivos de aprendizagem de cada UC. Comprovamos, também, que se não forem criadas situações em que os alunos sejam incentivados a questionar, situações que constituam para si um desafio, um estímulo extrínseco, apenas teremos acesso ao seu questionamento oral e espontâneo, com as características que já lhe são conhecidas. Afirmamos, assim, a relevância de se desenharem situações de ensino, aprendizagem e avaliação, que promovam nos alunos o desenvolvimento da competência de questionamento. Um outro objetivo central de investigação a que nos tínhamos proposto era a caracterização do questionamento dos alunos numa perspetiva mais holística, situando-o como uma competência fundamental que deverá ser desenvolvida em contextos educativos, mas também ao longo da vida. Avançamos com uma proposta de modelo de competência de questionamento, como um dos resultados principais do presente estudo. Este modelo surge de toda a experiência investigativa e, sobretudo, do estudo aprofundado de dois casos, correspondentes a dois alunos selecionados, que permitiu a elucidação das dimensões de competência. Assumindo o questionamento como competência, consideramos que o modelo proposto, e ainda em evolução, poderá representar um importante contributo para a teoria e para a prática do questionamento.

Abordagens ao ensino e práticas de questionamento no ensino superior

A emergência de uma nova Sociedade baseada na Informação e no Conhecimento despoletou transformações pedagógicas profundas nas instituições de Ensino Superior. Esta agenda para a inovação, no sentido de um ensino mais centrado nos alunos e no desenvolvimento de competências, tem exigido um esforço acrescido de toda a comunidade académica e, sobretudo, por parte dos professores universitários. Num contexto de recetividade para a mudança, mas com dificuldade de operacionalização da mesma, este estudo visa contribuir para a compreensão e superação de fatores que parecem dificultar a transposição da inovação para as práticas de ensino-aprendizagem correntes, através de duas frentes investigativas: i) caracterizar os docentes na sua dimensão conceptual, o que pensam e o que os motiva, e na sua dimensão prática, isto é, as estratégias didáticas que adotam e adaptam; e ainda, ii) criar oportunidades de concretização de inovação através do desenho de estratégias promotoras de questionamento dos alunos, e também dos docentes. A formulação de questões, e a procura de respostas, é reconhecida como sendo fundamental no desenvolvimento e na aplicação de competências centrais, tais como o pensamento crítico e reflexivo, sendo igualmente importante na resolução de problemas. Assim, numa articulação dinâmica entre conhecer, compreender e agir, a investigação envolveu uma colaboração próxima com um grupo de quatro docentes universitários, ao longo de dois anos letivos consecutivos (2009/2010 e 2010/2011), na conceptualização e implementação de diversas estratégias didáticas impulsionadoras do questionamento dos alunos, promovendo-se igualmente o questionamento reflexivo nos docentes. O trabalho foi desenvolvido no contexto de duas unidades curriculares semestrais (Microbiologia e Temas e Laboratórios em Biologia), destinadas sobretudo a alunos do primeiro ano. Enquanto estudo longitudinal de casos múltiplos, com características etnográficas e de investigação-ação, o trabalho de campo envolveu a combinação de diversos métodos de recolha de dados. Realizaram-se várias observações de aulas, assim como entrevistas semi-estruturadas, aos quatro professores colaboradores, e a alguns dos seus alunos. Aplicou-se ainda, em momentos específicos da investigação, uma versão portuguesa do Approaches to Teaching Inventory – ATI (Trigwell, Prosser, & Ginns, 2005) aos docentes. Recolheram-se também todos os documentos escritos produzidos pelos alunos e pelos professores no âmbito da investigação. Todo o desenho investigativo, assim como a análise dos dados, nomeadamente análise de conteúdo e análise documental, encontra-se fundamentado na literatura teórico-empírica de três áreas da especialidade: estudo do questionamento, análise do discurso oral em contexto de aulas de ciências e estudo das conceções e práticas de ensino dos docentes universitários, destacando-se nesta última a linha investigativa das Abordagens ao Ensino. Os resultados obtidos, assim como a reflexão sobre o percurso investigativo, possibilitaram a obtenção de contributos inovadores e úteis no sentido da promoção de um Ensino Superior de qualidade. Por um lado, são de salientar as evidências recolhidas com os quatro casos (docentes) que apontam para uma natureza integrativa das conceptualizações de ensino, constituindo um contributo teórico relevante para o debate académico desta área. Por outro, foi possível aceder a dinâmicas associadas à formulação de questões por docentes universitários em contexto de aulas teórico-práticas e práticas, através do desenvolvimento e aplicação de um modelo de categorização de questionamento. Por fim, a conjugação de evidências do campo das ‘teorias de ensino’ (observação indireta) com as ‘práticas de ensino’ (observação direta) dos docentes possibilitou a identificação e caracterização de uma possível relação entre Práticas de Questionamento e Abordagens ao Ensino de professores universitários, ampliando desta forma o modelo conceptual de Keith Trigwell e colaboradores (Trigwell, Prosser, & Taylor, 1994). Enquanto investigação híbrida que se orientou por princípios do paradigma interpretativo-naturalista, e, também, do paradigma sócio-crítico, foi igualmente possível identificar um conjunto de recomendações específicas para a inovação e para a reflexividade, no sentido de estimular a comunidade académica, e os professores universitários em particular, a agirem como promotores de estratégias didáticas centradas no desenvolvimento de competências.

Propriedades de lamas de salinas de Aveiro, tendo em vista aplicações dermoterapêuticas e dermocosméticas

Desde tempos históricos que diferentes tipos de lama são utilizados para aplicações externas no corpo humano, para fins terapêuticos e cosméticos. As lamas cuja beneficiação e caracterização físico-química são apresentadas nesta dissertação são formadas no ambiente hipersalino que existe nas salinas da Troncalhada e de São Tiago da Fonte, localizadas no estuário do rio Vouga, em Aveiro, Portugal. As salinas são constituídas por uma sequência de tanques onde, no período de verão, da água do mar e por evaporação natural, se produz sal marinho que precipita no último tanque (o cristalizador) do qual é extraído. Na base dos tanques ocorrem lamas que correspondem a sedimentos constituídos por material argiloso de cor preto-cinzento e que incorporam argila, silte, areia, bioclastos, sal, matéria orgânica e gás. A componente inorgânica da lama extraída do cristalizador foi estudada por Difracção de Raios-X (DRX) e Fluorescência de Raios-X (FRX), enquanto a componente orgânica da mesma lama foi estudada por Cromatografia de Gás- Espectrometria de Massa (GC-MS). Os estudos efectuados incidiram sobre amostras representativas de lama, obtidas antes e após refinação e beneficiação a que foi submetida a lama tal-qual colhida nas salinas. Foram utilizados métodos geofísicos para caracterizar e distinguir as lamas depositadas na época de safra e no período de interregno. Para o efeito, foram cravados tubos amostradores no sedimento que reveste o fundo dos tanques, tubos que seguidamente foram transportados para o laboratório para medição da condutividade eléctrica do topo até à base da coluna de sedimento amostrado. A refinação foi efectuada por elutriação de suspensões aquosas de lama utilizando um equipamento desenvolvido para o efeito e que permitiu concentrar a lama fina no overflow. Após floculação, sifonagem da água sobrenadante, dessalinização e centrifugação a lama refinada e beneficiada pôde ser incorporada em formulações com objectivos terapêuticos e cosméticos. O estudo microbiológico efectuado nas amostras de lama com sal e sem sal e na água das salinas permitiu identificar diversos tipos de bactérias e colónias presentes na lama e avaliar também os processos de esterilização testados. Concluiu-se que a lama hipersalina ou dessalinizada resultante do processamento a que foram submetidas, não deve ser aplicada ou incorporada em formulações tal-qual, pelo facto de em ambas terem sido identificadas bactérias como é o caso de Clostridium perfringens. Não obstante, se submetidas a esterilização utilizando autoclave a lama salina refinada e beneficiada poderá ser aplicada como peloide extemporâneo. Assim sendo foram desenvolvidas formulações dermoterapêuticas e dermocosméticas contendo lama beneficiada e dessalinizada e esterilizada termicamente.

Development of infrared spectroscopy for assessing bacterial quality in foods

Rapid and specific detection of foodborne bacteria that can cause food spoilage or illness associated to its consumption is an increasingly important task in food industry. Bacterial detection, identification, and classification are generally performed using traditional methods based on biochemical or serological tests and the molecular methods based on DNA or RNA fingerprints. However, these methodologies are expensive, time consuming and laborious. Infrared spectroscopy is a reliable, rapid, and economic technique which could be explored as a tool for bacterial analysis in the food industry. In this thesis it was evaluated the potential of IR spectroscopy to study the bacterial quality of foods. In Chapter 2, it was developed a calibration model that successfully allowed to predict the bacterial concentration of naturally contaminated cooked ham samples kept at refrigeration temperature during 8 days. In this part, it was developed the methodology that allowed the best reproducibility of spectra from bacteria colonies with minimal sample preparation, which was used in the subsequent work. Several attempts trying different resolutions and number of scans in the IR were made. A spectral resolution of 4 cm-1, with 32 scans were the settings that allowed the best results. Subsequently, in Chapter 3, it was made an attempt to identify 22 different foodborne bacterial genera/species using IR spectroscopy coupled with multivariate analysis. The principal component analysis, used as an exploratory technique, allowed to form distinct groups, each one corresponding to a different genus, in most of the cases. Then, a hierarchical cluster analysis was performed to further analyse the group formation and the possibility of distinction between species of the same bacterial genus. It was observed that IR spectroscopy not only is suitable to the distinction of the different genera, but also to differentiate species of the same genus, with the simultaneous use of principal component analysis and cluster analysis techniques. The utilization of IR spectroscopy and multivariate statistical analysis were also investigated in Chapter 4, in order to confirm the presence of Listeria monocytogenes and Salmonella spp. isolated from contaminated foods, after growth in selective medium. This would allow to substitute the traditional biochemical and serological methods that are used to confirm these pathogens and that delay the obtainment of the results up to 2 days. The obtained results allowed the distinction of 3 different Listeria species and the distinction of Salmonella spp. from other bacteria that can be mistaken with them. Finally, in chapter 5, high pressure processing, an emerging methodology that permits to produce microbiologically safe foods and extend their shelf-life, was applied to 12 foodborne bacteria to determine their resistance and the effects of pressure in cells. A treatment of 300 MPa, during 15 minutes at room temperature was applied. Gram-negative bacteria were inactivated to undetectable levels and Gram-positive showed different resistances. Bacillus cereus and Staphylococcus aureus decreased only 2 logs and Listeria innocua decreased about 5 logs. IR spectroscopy was performed in bacterial colonies before and after HPP in order to investigate the alterations of the cellular compounds. It was found that high pressure alters bands assigned to some cellular components as proteins, lipids, oligopolysaccharides, phosphate groups from the cell wall and nucleic acids, suggesting disruption of the cell envelopes. In this work, bacterial quantification and classification, as well as assessment of cellular compounds modification with high pressure processing were successfully performed. Taking this into account, it was showed that IR spectroscopy is a very promising technique to analyse bacteria in a simple and inexpensive manner.

Estudo da variação da abundância e diversidade de procariotas em sedimentos subsuperficiais marinhos

Os sedimentos marinhos subsuperficiais profundos são, atualmente, um ambiente ainda pouco conhecido do ponto de vista microbiológico, nomeadamente quanto aos processos metabólicos que nele têm lugar e quanto à sua possível influência nos ciclos biogeoquímicos. O acesso a amostras colhidas em sedimentos profundos, particularmente no âmbito dos programas IODP (International Ocean Discovery Program) e ECORD (European Consortium for Ocean Research Drilling) tem permitido recolher informação sobre a estrutura das comunidades de procariotas bem como sobre alguns dos fatores que regulam a sua distribuição e atividade. Este estudo teve como objetivo caracterizar a distribuição e a diversidade estrutural das comunidades de procariotas em sedimentos subsuperficiais profundos colhidos no Arco Izu-Bonin-Mariana, no mar das Filipinas, com recurso a métodos independentes de cultivo (PCR-DGGE) e à contagem de células por microscopia de epifluorescência. Os resultados apontam para a existência de comunidades de Bacteria e Archaea diversas. Os valores do índice de diversidade de Shannon-Weaver (H’) calculados com base nos perfis de DGGE (Bacteria) foram significativamente mais elevados (3,035 – 1,971) nas camadas superficiais (< 140 mafm) do que nos sedimentos (2,519 - 1,049) correspondentes a profundidades superiores entre 163 e 879 mafm. A abundância máxima (8,66 x 106 células.gps-1) foi registada à profundidade de 67 mafm e valor mínimo (2,26 x 106 células.gps-1) foi observado em amostras colhidas a 879 mafm de profundidade. Abundância e diversidade apresentaram correlação negativa com a profundidade e com o teor de sulfato. Os resultados indicam que ao longo da coluna de sedimento se estabelecem comunidades de procariotas estruturalmente diferentes e adaptadas ao ambiente geoquímico prevalecente, nomeadamente em termos dos aceitadores de eletrões disponíveis. O estudo do microbioma destas amostras representativas do ambiente sedimentar subsuperficial profundo será continuado e detalhado, com recurso a técnicas de sequenciação avançada.