Phylogenetic and functional diversity of estuarine bacterioneuston

A micro-camada superficial da água (SML) é caracterizada pela ocorrência de grandes quantidades de compostos orgânicos, pela acumulação de contaminantes antropogênicos e é submetida a uma intensa radiação solar, extrema mudança de temperatura e, no caso dos estuários, flutuação de salinidade. Estas propriedades físico-químicas estão, provavelmente, a modular a comunidade bacteriana (bacterioneuston) com propriedades filogenéticas e funcionais específicas. Neste estudo, as abordagens dependentes e independentes do cultivo foram aplicadas para avaliar a estrutura e dinâmica das comunidades bacterioneuston e bacterioplâncton em três localizações geográficas ao longo do estuário da Ria de Aveiro. Além disso, comparámos a diversidade filogenética de grupos específicos (Aeromonas, Pseudomonas e Psychrobacter) presentes em bacterioneuston e bacterioplâncton. Finalmente, as duas comunidades foram comparadas em termos de prevalência e diversidade de bactérias resistentes aos antibióticos e respetivos genes de resistência. Bactérias heterotróficas cultiváveis foram enriquecidas em SML. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) permitiu a identificação de filotipos específicos em SML. Além disso, a análise de agrupamento dos perfis de DGGE de ambas as comunidades revelou uma ligeira tendência de agrupamento de acordo com a camada amostrada. As diferenças entre as duas comunidades variaram de acordo com factores espaciais e temporais. Em termos de diversidade filogenética de grupos específicos, não foram identificadas diferenças consistentes entre SML e UW com relação às comunidades de Aeromonas. Com relação ao género Pseudomonas, uma unidade operacional taxonómica cultivável foi consistentemente hiper-representada nas amostras de SML. Metodologias dependentes e independentes do cultivo revelaram a presença de populações de Psychrobacter complexas e muito estáveis em todos os sítios e datas de amostragens, com diferenças significativas entre as comunidades de Psychrobacter presentes em SML e UW. Estirpes representativas de prováveis novas espécies também foram cultivadas. Em termos de resistência aos antibióticos, a prevalência de bactérias resistentes em SML foi alta sugerindo selecção pelas condições presentes em SML. É preciso enfatizar que a resistência aos antibióticos foi incomum entre as bactérias estuarinas e os mecanismos de resistência foram, predominantemente, intrínsecos. Pela combinação de abordagens inovadoras dependentes e independentes do cultivo, este estudo forneceu novas e consistentes informações com relação às diferenças em ambas as comunidades bacterianas e em relação a alguns dos fatores que contribuem para a sua formação.

Diversity of Aeromonas species from different environments in Portugal

Espécies de Aeromonas encontram-se distribuídas por diferentes habitats, estando especialmente relacionadas com ambientes aquáticos. O seu papel em complicações na saúde humana e animal é reconhecido. De facto, não só pelo seu potencial de virulência, mas também pelos determinantes genéticos de resistência a antibióticos que possam conter, estes organismos constituem uma preocupação na medicina humana e veterinária. Assim, é essencial o estudo da diversidade de espécies de Aeromonas bem como explorar as suas características fenotípicas e genéticas que podem conduzir a impactos negativos. A água constitui um importante veículo de transmissão de microrganismos e espécies de Aeromonas estão amplamente distribuídas em águas tratadas e não tratadas. Em Portugal é ainda comum o consumo de águas não tratadas cuja qualidade, na maioria das vezes, não é sujeita a monitorização, como acontece por exemplo, em explorações agrícolas de gestão familiar. Neste estudo, investigou-se a presença de Aeromonas em águas não tratadas para consumo. Estabeleceu-se também uma linha horizontal de colheitas de diferentes amostras de origem agrícola com o intuito de avaliar a possibilidade de a água ser uma das vias de contaminação de culturas agrícolas e animais por espécies de Aeromonas. Obtiveram-se 483 isolados que foram discriminados por RAPD-PCR. 169 estirpes distintas foram identificadas ao nível da espécie por análise filogenética baseada no gene gyrB. Verificou-se uma frequente ocorrência bem como uma diversidade considerável de espécies de Aeromonas. Em alguns casos, as relações genotípicas entre isolados de diferentes amostras eram muito próximas. Adicionalmente, a maioria das amostras continha diferentes espécies e estirpes distintas da mesma espécie. A. media e A. hydrophila foram as espécies mais ocorrentes. Um grupo de isolados apresentou variantes moleculares de gyrB diferente das conhecidas até agora, o que indica que poderão constituir espécies não descritas. O perfil de susceptibilidade da colecção de Aeromonas a diferentes antibióticos foi estabelecido, constituindo um perfil típico do género, com algumas excepções. Estirpes multirresistentes foram encontradas. A presença de genes tet e bla foi investigada por estudos de PCR, hibridação e, em alguns casos, de sequenciação. Como era esperado, cphA/imiS foi o mais detectado. A detecção de integrões fez-se por PCR e hibridação e a sua caracterização foi feita por sequenciação de DNA; a sua ocorrência foi reduzida. A maioria das estirpes sintetizou enzimas extracelulares com actividade lipolítica e proteolítica que potencialmente contribuem para virulência. A análise por PCR e hibridação permitiram a detecção de vários determinantes genéticos que codificam moléculas possivelmente envolvidas em processos patogénicos. Diversas espécies de Aeromonas apresentando características relacionadas com resistência a antibióticos e potencialmente de virulência estão frequentemente presentes em produtos para consumo humano e animal em Portugal. ABSTRACT: Aeromonas spp. are present in a wide range of ecological niches, being mainly related to aquatic environments. Their role in human and animal health complications is recognised. In fact, not only for their putative virulence but also for the antibiotic resistance genetic determinants Aeromonas may harbour, these organisms constitute an issue of concern in human and veterinary medicine. Thus, it is essential to get knowledge on Aeromonas sp. diversity and on their genotypic and phenotypic characteristics that may lead to negative impacts. Water constitutes a good contamination route for microorganisms and Aeromonas are widespread in untreated and treated waters from different sources. In Portugal there is still an extensive use of untreated water which is not regularly monitored for quality. This is often the case in family smallholding farms. In this study untreated drinking and mineral waters were assessed for their content in Aeromonas spp. Furthermore, a sampling scheme was designed to investigate the occurrence and diversity of Aeromonas sp. in different agricultural correlated sources and to assess the possibility of water being the transmission vehicle between those sources. 483 isolates were obtained and discriminated by RAPD-PCR. Identification at the species level for 169 distinct strains was done by gyrB based phylogenetic analysis. Results demonstrated the frequent occurrence and considerable diversity of Aeromonas spp. In some cases, genotypic close relations were found between isolates from different sources. Also, most samples contained different species and distinct strains of the same species. A. media and A. hydrophila were the most occurring. A group of isolates displayed gyrB gene sequences distinct from the previously known, indicating that they may constitute representatives of non-described species. The antibiotic susceptibility profile of the aeromonads collection was established and constituted a typical profile of the genus, although few exceptions. Multiresistance patterns were found. The presence of tet and bla genes was investigated by PCR, hybridisation and, in some cases, sequencing analysis. As expected, cphA/imiS was the most detected. Integrons were screened by PCR and hybridisation and characterised by DNA sequencing; low occurrence was recorded. The bulk of strains was able to produce extracellular enzymes with lipolytic and proteolytic activities, which may contribute to virulence. PCR and hybridisation surveys allowed the detection of distinct genetic determinants coding for molecules putatively involved in pathogenic processes. Diverse Aeromonas sp. presenting distinct antibiotic resistance features and putative virulence traits are frequently present in many sources for human and animal consumption in Portugal.

Biodiversity and molecular evolution of malacostraca

No actual cenário de perda acelerada de biodiversidade, o nosso conhecimento dos ecossistemas marinhos, apesar da sua extensão e complexidade, continua muito inferior ao dos ecossistemas terrestres. A classe Malacostraca (Arthropoda, Crustacea), um grupo dos mais representativos nos ecossistemas marinhos, apresenta um elevado nível de diversidade morfológica e ecológica, mas difícil sua identificação ao nível de espécie requer frequentemente a ajuda de especialistas em taxonomia. A utilização recente do “barcoding” (código de barras do ADN), revelou ser um método rápido e eficaz para a identificação de espécies em diversos grupos de metazoários, incluindo os Malacostraca. No âmbito desta tese foi construída uma base de dados de código de barras de ADN envolvendo 132 espécies de Malacostraca vários locais de amostragem no Atlântico Nordeste e Mediterrâneo. As sequências de ADN mitocondrial provenientes de 601 espécimes formaram, em 95% dos casos, grupos congruentes com as identificações baseadas em características morfológicas. No entanto, foi detectado polimorfismo em seis casos e a divergência intra-específica foi elevada em exemplares pertencentes a duas espécies morfológicas, sugerindo, neste caso, a ocorrência de especiação críptica. Este estudo confirma a utilidade do código de barras de ADN para a identificação de Malacostraca marinhos. Apesar do sucesso obtido, este método apresenta alguns problemas, como por exemplo a possível amplificação de pseudogenes. A ocorrência de pseudogenes e as possíveisabordagens para a detecção e resolução deste tipo de problemas são discutidas com base em casos de estudo: análises dos códigos de barras ADN na espécie Goneplax rhomboides (Crustacea, Decapoda). A análise dos códigos de barras ADN revelou ainda grupos prioritários de decápodes para estudos taxonómicos e sistemáticos, nomeadamente os decápodes dos géneros Plesionika e Pagurus. Neste âmbito são discutidas as relações filogenéticas entre espécies seleccionadas dos géneros Plesionika e Pagurus. Este trabalho aponta para várias questões no âmbito da biodiversidade e evolução molecular da classe Malacostraca que carecem de um maior esclarecimento, podendo ser considerado como a base para estudo futuros. Análises filogenéticas adicionais integrando dados morfológicos e moleculares de um maior número de espécies e de famílias deverão certamente conduzir a uma melhor avaliação da biodiversidade e da evolução dentro da classe.