Study of the Cd complexation mechanism by glutathione in Rhizobium leguminosarum

A associação simbiótica de plantas leguminosas com bactérias do género Rhizobium é o maior e mais eficiente contribuinte de azoto fixado biologicamente (Somasegaran e Hoben, 1994; Zahran, 1999). No entanto, o constante aumento da poluição em solos agrícolas, nomeadamente a contaminação por metais devido à aplicação de fertilizantes e de lamas, está a tornar-se um problema ambiental cada vez mais preocupante (Alloway, 1995a; Giller et al., 1998; Permina et al., 2006; Thorsen et al., 2009; Wani et al., 2008), influenciando de forma negativa a persistência destas bactérias nos solos agrícolas, assim como a sua eficácia de nodulação (Broos et al., 2005; Wani et al., 2008;. Zhengwei et al., 2005). Desta forma, o estudo dos mecanismos de tolerância de Rhizobium a metais tornou-se uma área de investigação de elevada importância. Com o trabalho apresentado nesta tese pretendeu-se perceber melhor a tolerância Rhizobium leguminosarum ao cádmio (Cd), dando particular atenção a um mecanismo de tolerância previamente descrito em R. leguminosarum (Lima et al., 2006): a complexação intracelular de Cd pelo tripéptido glutationa (GSH). Assim, o principal objectivo deste trabalho foi perceber melhor qual a importância deste mecanismo nos níveis de tolerância de rizóbio ao Cd. Como já tinha sido descrito em trabalhos anteriores (Figueira et al., 2005; Lima et al., 2006), foi possível verificar que a estirpe mais tolerante ao metal apresenta níveis mais elevados de Cd e GSH intracelulares. Demonstrou-se ainda que a tolerância ao Cd está dependente da maior eficiência no mecanismo de complexação observada na estirpe tolerante, logo durante as primeiras 12 h de crescimento. Gomes et al. (2002) verificou que a acumulação de complexos GSH-Cd no citoplasma inibe a entrada de metal na célula. Como neste trabalho se observou um aumento nos níveis de Cd intracelular na estirpe tolerante ao longo do tempo, surgiu a hipótese dos complexos serem excretados para o espaço periplasmático. Os elevados níveis de GSH e de Cd determinados no espaço periplasmático corroboraram esta hipótese. Neste trabalho demonstrou-se ainda que a eficácia do mecanismo de complexação, depende da actividade enzimática de uma isoforma específica de GST, que apresentou um elevado acréscimo de actividade na presença do metal. Desta forma, os resultados desta tese indicam que, a maior tolerância de R. leguminosarum ao Cd, depende da capacidade das estirpes para induzir a síntese de GSH na presença de Cd e, simultaneamente aumentar a actividade enzimática da GST específica, optimizando assim o mecanismo de complexação de Cd intracelular.

Methodologies for a sustainable development of estuarine ecosystems

As zonas costeiras, estuarinas e lagunares são consideradas áreas muito produtivas e dotadas de grande biodiversidade sendo, por isso, consideradas de elevado valor ecológico e económico. No entanto, nas últimas décadas tem vindo a verificar-se um aumento da contaminação destes ecossistemas como resultado de diversas actividades antrópicas. As abordagens actualmente disponíveis para avaliação do impacto da poluição em ecossistemas estuarinos e lagunares apresentam diversos tipos de lacunas, pelo que é importante desenvolver metodologias mais eficazes com organismos autóctones. Neste contexto, o objectivo central desta dissertação consistiu em desenvolver e validar métodos ecologicamente relevantes para avaliação da contaminação estuarina e dos seus efeitos, utilizando o góbio-comum (Pomatoschistus microps), quer como organismo-teste quer como espécie sentinela, devido à importante função que desempenha nas cadeias tróficas de diversos estuários da costa Portuguesa. A Ria de Aveiro foi seleccionada como área de estudo principalmente pelo facto de possuir zonas com diferentes tipos de contaminação predominante e de haver conhecimento científico de base abundante e de elevada qualidade sobre este ecosistema. Na primeira fase do estudo, foram investigados os efeitos agudos de dois hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) (benzo[a]pireno e antraceno), de um fuel-óleo e de dois metais (cobre e mercúrio) em P. microps, utilizando ensaios laboratoriais baseados em biomarcadores e em parâmetros comportamentais, os quais foram avaliados utilizando um dispositivo expressamente desenvolvido para o efeito, designado por speed performance device (SPEDE). Como biomarcadores foram utilizados parâmetros envolvidos em funções fisiológicas determinantes para a sobrevivência e desempenho dos animais (neurotransmissão, obtenção de energia, destoxificação e defesas anti-oxidantes), nomeadamente a actividade das enzimas acetilcolinesterase, lactato desidrogenase, CYP1A1, glutationa S-transferases, glutationa reductase, glutationa peroxidase, superóxido dismutase, catalase, tendo ainda sido determinados os níveis de peroxidação lipídica como indicador de danos oxidativos. De forma global, os resultados indicaram que os agentes e a mistura testados têm a capacidade de interferir com a função neurológica, de alterar as vias utilizadas para obtenção de energia celular, induzir as defesas antioxidantes e, no caso do cobre e do mercúrio, de causarem peroxidação lipídica. Foram ainda obtidas relações concentração-resposta a nível dos parâmetros comportamentais testados, nomeadamente a capacidade de nadar contra a corrente e a distância percorrida a nadar contra o fluxo de água, sugerindo que os agentes testados podem, por exemplo, diminuir a capacidade de fuga aos predadores, as probabilidades de captura de presas e o sucesso reprodutivo. Na segunda fase, tendo sido já adaptadas técnicas para determinação de vários biomarcadores em P. microps e estudada a sua resposta a dois grupos de poluentes particularmente relevantes em ecossistemas estuarinos e lagunares (metais e HAPs), foi efectuado um estudo de monitorização utilizando P. microps como bioindicador e que incluiu diversos parâmetros ecológicos e ecotoxicológicos, nomedamente: 20 parâmetros indicativos da qualidade da água e do sedimento, concentração de 9 metais em sedimentos e no corpo de P. microps, 8 biomarcadores e 2 índices de condição na espécie seleccionada. A amostragem foi efectuada em quatro locais da Ria de Aveiro, um considerado como referência (Barra) e três com diferentes tipos predominantes de contaminação (Vagueira, Porto de Aveiro e Cais do Bico), sazonalmente, durante um ano. Os resultados obtidos permitiram uma caracterização ecotoxicológica dos locais, incluindo informação sobre a qualidade da água, concentrações de contaminantes ambientais prioritários nos sedimentos e nos tecidos de P. microps, capacidade desta espécie para bioacumular metais, efeitos exercidos pelas complexas misturas de poluentes presentes em cada uma das zonas de amostragem nesta espécie e possíveis consequências para a população. A análise multivariada permitiu analisar de forma integrada todos os resultados, proporcionando informação que não poderia ser obtida analisando os dados de forma compartimentalizada. Em conclusão, os resultados obtidos no âmbito desta dissertação indicam que P. microps possui características adequadas para ser utilizado como organismoteste em ensaios laboratoriais (e.g. abundância, fácil manutenção, permite a determinação de diferentes tipos de critérios de efeito utilizando um número relativamente reduzido de animais, entre outras) e como organismo sentinela em estudos de monitorização da poluição e da qualidade ambiental, estando portanto de acordo com estudos de menor dimensão previamente efectuados. O trabalho desenvolvido permitiu ainda adaptar a P. microps diversas técnicas bioquímicas vulgarmente utilizadas como biomarcadores em Ecotoxicologia e validá-las quer no laboratório quer em cenários reais; desenvolver um novo bioensaio, utilizando um dispositivo de teste especialmente concebido para peixes epibentónicos baseado na performance natatória de uma espécie autóctone e em biomarcadores; relacionar os efeitos a nível bioquímico com parâmetros comportamentais que ao serem afectados podem reduzir de forma drástica e diversificada (e.g. aumento da mortalidade, diminuição do sucesso reprodutivo, redução do crescimento) a contribuição individual para a população. Finalmente, foi validada uma abordagem multidisciplinar, combinando metodologias ecológicas, ecotoxicológicas e químicas que, quando considerada de forma integrada utilizando análises de estatística multivariada, fornece informação científica da maior relevância susceptível de ser utilizada como suporte a medidas de conservação e gestão em estuários e sistemas lagunares.

Efeitos genotóxicos e bioquímicos de xenobióticos em animais aquáticos

No presente trabalho, foi estudado um largo espectro de efeitos genotóxicos e bioquímicos na tainha-garrento (Liza aurata). Nos Capítulos II e III são descritos os efeitos de exposição de curta duração ao fenantreno, um hidrocarboneto aromático policíclico (HAP). A exposição de curta duração (16 horas) demonstrou a capacidade deste composto induzir a actividade da enzima de fase I da biotransformação, etoxiresorufina O-desetilase (EROD), provocar decréscimos de integridade no ADN hepático e aumento de anomalias nucleares eritrocíticas (ANE). Em termos de respostas de stresse, os níveis plasmáticos de cortisol e glucose aumentaram face à exposição a este HAP. A exposição ao fenantreno induziu o decréscimo da glutationa peroxidase (GPx) nas guelras, enquanto que no fígado a actividade da GPx aumentou. No rim, a actividade da glutationa S-transferase (GST) foi inibida. Nas guelras, verificou-se um aumento da catalase. O fenantreno demonstrou igualmente a capacidade de induzir um aumento dos níveis de glutationa nas guelras e fígado. Estas respostas demonstraram a sensibilidade de L. aurata, a este HAP, realçando a especificidade das respostas em termos de órgãos. Apesar dos aumentos das defesas antioxidantes, o potencial tóxico deste composto foi demonstrado pelo aumento da peroxidação lipídica nos três órgãos. Nos capítulos seguintes, são descritas as respostas de L. aurata capturada na Ria de Aveiro, em locais com diferentes perfis de contaminação, inicialmente no Outono de 2005 (Capítulos III a IX) e posteriormente analisando respostas sazonais (Capítulos X e XI). A análise de respostas de stresse (cortisol, glucose e lactato) revelou que L. aurata capturada em Vagos (local contaminado por HAPs) apresentava níveis baixos de cortisol, enquanto que no Laranjo (local contaminado por mercúrio) apresentavam elevados níveis de glucose e lactato. Relativamente às hormonas do eixo hipotálamo – hipófise – tiróide (HHT), foram observados elevados níveis plasmáticos da hormona estimuladora da tiróide (TSH) nos organismos capturados no Laranjo, baixos níveis de tiroxina (T4) nos organismos da Barra (local sujeito a tráfego naval) e baixos níveis de triiodotironina (T3) no Rio Novo do Príncipe (próximo de um antigo efluente de pasta de papel), Laranjo e Vagos. A avaliação das defesas antioxidantes, dano oxidativo e genotóxico nas guelras, rim e fígado revelou diferenças significativas nas respostas dos órgãos. L. aurata capturada na Barra apresentou dano oxidativo nas guelras (Capítulo V). No rim foi detectada uma diminuição da integridade do ADN no Rio Novo do Príncipe e Vagos (Capítulo VI), enquanto que no fígado foi observado dano lipídico na Gafanha e Vagos (Capítulo VIII). O dano não esteve sempre associado a um decréscimo das defesas. As análises da água e do sedimento da Ria de Aveiro (Outono de 2005) revelaram elevadas concentrações de metais (Cd, Hg, Cu e Zn),principalmente, no Laranjo e Rio Novo do Príncipe. L. aurata capturada nestes locais apresentou os níveis mais elevados de metalotioninas hepáticas (Capítulo VII) que parecem responsáveis pela inexistência de danos no fígado (Capítulo VIII). O dano oxidativo no ADN, avaliado através da quantificação dos níveis plasmáticos de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina (8-OHdG) e o dano clastogénico/aneugénico, avaliado através da quantificação da frequência de ANE, foram estudados, no Outono de 2005, em duas espécies de peixes (L. aurata e Dicentrarchus labrax - robalo) (Capítulo IX). Os resultados revelaram grande sensibilidade de D. labrax em termos de dano oxidativo no ADN na Gafanha, Rio Novo do Príncipe e Vagos, enquanto que L. aurata apresentou dano oxidativo apenas no Laranjo. O aumento da frequência de ANE apenas foi detectado em L. aurata, em Vagos, não se tendo detectado correlação entre estes dois parâmetros. O estudo sazonal (Maio de 2006 a Março de 2007) do dano oxidativo no ADN e frequência de ANE em L. aurata (Capítulo X) demonstrou a variação destes parâmetros com a estação do ano, apesar de não se ter verificado correlação com os parâmetros hidrológicos determinados. No entanto, no local de referência não se verificaram diferenças sazonais, o que sugere que estes biomarcadores reflectem variações de biodisponibilidade de contaminantes. A análise global dos resultados das diferentes estações do ano revelou que L. aurata capturada no Rio Novo do Príncipe e em Vagos apresentou maior susceptibilidade a dano oxidativo no ADN. No entanto, apenas L. aurata capturada em Vagos apresentou frequência de ANE superior à do local de referência. Os dados do estudo sazonal revelaram uma correlação entre dano oxidativo e ANE, sugerindo o stresse oxidativo como um possível mecanismo envolvido na formação de anomalias. A integridade do ADN das guelras, rim, fígado e sangue de L. aurata foi igualmente estudada ao longo de um ano (Capítulo XI), tendo-se verificado uma grande variabilidade ao longo deste período. Não foi demonstrada sensibilidade a um perfil de contaminação específico, tendo-se verificando variabilidade sazonal no local de referência. Globalmente, os resultados demonstraram a importância da utilização de uma bateria de biomarcadores na monitorização ambiental e a especificidade da resposta dos diferentes órgãos de L. aurata.

Phytochelatin signal tranduction and cadmium chelation in plants

As plantas utilizam diversas estratégias de sinalização para reconhecer e responder aos stresses ambientais. A maioria das vias de transdução de sinais partilham um sinal genérico, normalmente a modulação dos níveis intracelulares de Ca2+. Esta por sua vez pode iniciar uma cascata de fosforilação proteica que finalmente afecta as proteínas directamente envolvidas na protecção celular ou culmina em factores de transcrição que vão determinar a resposta fisiológica ao stresse. A percepção destes sinais e a compreensão de como estes podem activar as respostas adaptativas são factores-chave para a tolerância das plantas a stresses abióticos. Um dos principais stresses abóticos que restrigem o crescimento das plantas é a presença de metais pesados. A produção de fitoquelatinas e a subsequente quelação dos metais é o mecanismo mais conhecido de tolerância ao stresse metálico em plantas. Fitoquelatinas (PCs) são péptidos com grupos tiol que são sintetizados através da transpeptidação da glutationa (GSH), pela acção da enzima fitoquelatina sintase (PCS). No entanto, até ao momento, as vias de sinalização que levam à síntese de fitoquelatinas e à percepção do stresse metálico são pouco compreendidas. Dentro deste contexto, o presente trabalho foi elaborado com o intuito de elucidar a via de sinalização através da qual o cádmio é detectado pelas células vegetais e induz a síntese de PCs. Quase todos, os estudos de stresses abióticos em plantas apontam para o facto de a sua sinalização se basear nos mesmos tipos de sinais moleculares, nomeadamente a sinalização por cálcio, a fosforilação proteica e a indução de espécies reactivas de oxigénio (ROS). Trabalhos recentes sugerem que a sinalização de PCs poderá envolver todos estes parâmetros. Assim, uma primeira abordagem foi efectuada para compreender a síntese de PCs na espécie Arabidopsis thaliana, através da monitorizaçção da actividade de enzimas relacionadas, a γ-EC sintetase, GSH sintetase e a PC sintase (PCS), assim como o tempo necessário para o elongamento das PCs e a sua acumulação. Seguidamente, ao longo deste processo foi analisada a expressão de sinais específicos, associados com sinais de cálcio, fosforilação proteica e sinalização por ROS. A importância destes factores na síntese de PCs foi também avaliada através do uso de moduladores farmacológicos de cálcio e fosfatases proteicas e também pela indução de stresse oxidativo. Os resultados demonstraram novos dados sobre o papel do cálcio e da fosforilação proteica na produção de PCs e na síntese de GSH, revelando que a actvidade da PCS é regulada por fosforilação e que a sinalização de cálcio pode mediar a síntese de GSH. O envolvimento da sinalização de ROS na síntese de GSH, atráves de crosstalk com a sinalização de cálcio também foi proposta. Assim, os resultados aqui apresentados descrevem uma possível via de sinalização de cádmio nas plantas e da indução de fitoquelatinas. Este trabalho poderá ser portanto muito útil na implementação de novas metodologias de agricultura sustentável e práticas de fitorremediação em solos contaminados com metais pesados.

Mercury in feral fish: distribution, accumulation and toxicity

O principal objectivo desta dissertação foi estudar a acumulação de mercúrio em vários tecidos de peixes marinhos, a sua relação com factores biológicos e as respectivas respostas bioquímicas. O trabalho realizado permitiu obter novos conhecimentos sobre a acumulação de mercúrio em peixes, possibilitando avaliar a influência da biodisponibilidade do elemento e as suas possíveis implicações no ambiente. O trabalho foi desenvolvido na Ria de Aveiro (Portugal), uma zona costeira onde existe um gradiente ambiental de mercúrio, o que oferece a oportunidade de estudar a sua acumulação e os seus efeitos tóxicos em condições realísticas. As amostragens foram efectuadas em dois locais considerados críticos em termos de contaminação por mercúrio – Largo do Laranjo (L1 e L2) e num local afastado da principal fonte de poluição, usado como termo de comparação (Referência; R); L1 e L2 corresponderam a locais moderadamente e altamente contaminados, respectivamente. Foram escolhidos juvenis de duas espécies ecologicamente diferentes e representativas da comunidade piscícola local, a tainha garrento (Liza aurata) e o robalo (Dicentrarchus labrax). Em cada local foram recolhidas amostras de água e de sedimento para determinação de mercúrio. Foram quantificadas as concentrações de mercúrio total (T-Hg) e orgânico (O-Hg) em vários tecidos dos peixes, escolhidos tendo em conta a sua função relativamente à toxicocinética e toxicodinâmica de metais. As respostas antioxidantes (Catalase- CAT, glutationa peroxidase- GPx, glutationa reductase- GR, glutationa –S-transferase- GST e conteúdo em glutationa total- GSHt), o dano peroxidativo (LPO) e o conteúdo em metalotioninas (MTs) foram também avaliados. A acumulação de T-Hg foi semelhante para as duas espécies de peixes estudadas, embora D. labrax tenha apresentado concentrações tendencialmente maiores. Ambas as espécies demonstraram capacidade de reflectir o grau de contaminação ambiental existente, indicando claramente que a acumulação depende da concentração ambiental. A acumulação revelou-se específica de cada tecido. O padrão da acumulação em L. aurata foi rim > fígado > músculo > cérebro > guelras > sangue e em D. labrax foi fígado > rim > músculo > cérebro ≈ guelras > sangue. Relativamente à acumulação de OHg, verificou-se que D. labrax exibiu concentrações mais elevadas que L. aurata. Todos os tecidos foram capazes de reflectir diferenças entre R e L2. Os níveis de O-Hg no fígado, músculo e nos conteúdos intestinais foram diferentes entre espécies, sendo mais elevados para D. labrax. As guelras e o intestino foram os tecidos onde se obtiveram os valores mais baixos de O-Hg e observaram-se valores idênticos para as duas espécies. Com excepção das guelras, as concentrações de O-Hg variaram em função do valor observado nos conteúdos intestinais, indicando que a alimentação é a via dominante da acumulação. As concentrações de O-Hg nos conteúdos intestinais revelaram ser uma informação relevante para prever a acumulação de O-Hg nos tecidos, pois verificou-se uma razão praticamente constante entre o teor de mercúrio no fígado, no músculo e nos conteúdos intestinais. A percentagem de O-Hg no músculo e no fígado variou de acordo com o grau de contaminação ambiental e com o tipo de assimilação preferencial do elemento (alimentação vs. água), sugerindo que o fígado exerce um papel protector em relação à acumulação de mercúrio nos outros órgãos. Ambas as espécies de peixes demonstraram ser boas sentinelas da contaminação ambiental com mercúrio (T-Hg e O-Hg), sendo o cérebro e o músculo os tecidos que melhor reflectiram o grau de acumulação com o elemento. A análise conjunta dos dados de bioacumulação e de respostas ao stress oxidativo permitiram estabelecer uma relação entre as concentrações de mercúrio nas guelras, fígado, rim e cérebro e a sua toxicidade. As respostas do cérebro aos efeitos tóxicos do mercúrio revelaram ser específicas de cada espécie. Enquanto que para o cérebro de L. aurata se verificou um decréscimo de todos os parâmetros antioxidantes estudados nos locais contaminados, sem haver evidência de qualquer mecanismo compensatório, no D. labrax observaram-se respostas ambivalentes, que indicam por um lado a activação de mecanismos adaptativos e, por outro, o decréscimo das respostas antioxidantes, ou seja, sinais de toxicidade. Embora em ambas as espécies de peixe fosse evidente uma condição pró-oxidante, o cérebro parece possuir mecanismos compensatórios eficientes, uma vez que não se verificou peroxidação lipídica. As respostas antioxidantes do cérebro de D. labrax foram comparadas em diferentes períodos do ano - quente vs. frio. O período quente mostrou ser mais crítico, uma vez que no período frio não se verificaram diferenças nas respostas entre locais, ou seja, a capacidade antioxidante do cérebro parece ser influenciada pelos factores ambientais. As guelras revelaram susceptibilidade à contaminação por mercúrio, uma vez que se verificou uma tendência para o decréscimo da actividade de CAT em L2 e ausência de indução em L1. O fígado e o rim demonstraram mecanismos adaptativos face ao grau de contaminação moderada (L1), evidenciados pelo aumento de CAT. O rim também demonstrou adaptabilidade face ao grau elevado de contaminação (L2), uma vez que se verificou um aumento GST. Embora o grau de susceptibilidade tenha sido diferente entre os órgãos, não se verificou peroxidação lipídica em nenhum. A determinação do conteúdo em MTs em D. labrax e em L. aurata revelou que este parâmetro depende não só da espécie, mas também do tecido em causa. Assim, em D. labrax foi observado um decréscimo de MTs no cérebro, bem como a incapacidade de síntese de MTs no sangue, guelras, fígado, rim e músculo. Em L. aurata observou-se um aumento do conteúdo em MTs no fígado e no músculo. Estes resultados indicam que a aplicabilidade das MTs como biomarcador de exposição ao mercúrio parece ser incerta, revelando limitações na capacidade de reflectir os níveis de exposição ao metal e por consequência o grau de acumulação. Este trabalho comprova a necessidade de se integrarem estudos de bioacumulação com biomarcadores de efeitos, de modo a reduzir os riscos de interpretações erróneas, uma vez que as respostas nem sempre ocorrem para os níveis mais altos de contaminação ambiental com mercúrio.

Aluminium toxicity in wheat and rye

Com o presente trabalho pretendeu-se determinar e compreender melhor quais os alvos do Alumínio (Al) nas plantas, e contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos de tolerância presentes em genótipos com elevado grau de tolerância ao Al. O Al é um dos maiores constituintes do solo e torna-se biodisponível em solos com baixo pH. Nesses casos, a exposição ao Al afecta negativamente o crescimento das plantas conduzindo a uma diminuição da produção. Estes factos são especialmente visíveis nos cereais, sendo a exposição ao Al uma das principais causas das quebras de produção nestas espécies. O Capítulo I consiste numa revisão geral sobre a toxicidade do Al nas plantas, apontando os seus principais alvos. Apresenta também os mecanismos de resistência, que inclui Al-destoxificação externa e interna, em diferentes espécies. O Capítulo II aborda os estudos sobre a exposição de curto prazo ao Al em duas espécies de cereais: Triticum aestivum L. e Secale cereale L., tendo-se sempre utilizado um genótipo Al-tolerante e um Al-sensível para cada espécie. Este capítulo está dividido em três estudos: no Capítulo II.1 realça-se o efeito da exposição a 185 μM de Al no equilíbrio nutricional em trigo. Verificou-se que em ambos os genótipos (sensível e tolerante) o perfil de macro e micro nutrientes se alterou, tendo uma interferência negativa, sobretudo no nível de P, Mg e K. Além disso, registaram-se diferenças na diferenciação da endoderme consoante o grau de tolerância/sensibilidade do genótipo. No Capítulo II.2 apresenta-se uma visão mais abrangente dos efeitos da exposição a 185 μM de Al em trigo, incluindo parâmetros fisiológicos, estruturais, citológicos e genotóxicos. Demonstra-se, pela primeira vez, que a progressão do ciclo celular é diferentemente regulada, dependendo da tolerância/sensibilidade do genótipo e que, mesmo em zonas já diferenciadas da raiz a exposição ao Al leva à deposição de calose. O Capítulo II.3 aborda os efeitos da exposição de 1.1 mM de Al em centeio, numa perspectiva bastante alargada. Apresenta-se o desequilíbrio nutricional, sobretudo no genótipo sensível, assim como a translocação de Al para a parte aérea nesse mesmo genótipo. Analisa-se também o comportamento de ambos os genótipos no que se refere ao ciclo celular, diferenciação da endoderme, crescimento radicular, reservas de hidratos de carbono, entre outros. Os resultados apontam para estratégias bem definidas adoptadas pelo genótipo tolerante de forma a minimizar a acção do Al no sistema radicular. O Capítulo III compreende a exposição longa ao Al. Dois genótipos de centeio com diferentes graus de tolerância ao Al foram expostos a 1.11 mM e 1.85 mM de Al durante 21 dias, tendo sido usados dois pontos de amostragem (15 e 21 dias). Este capítulo está dividido em dois estudos: No Capítulo III. 1 analisamse os mecanismos antioxidantes (folhas e raízes) como resposta à exposição ao Al, dando-se especial atenção ao ciclo do ascorbato-glutationas. A exposição ao Al levou a stress oxidativo e a alterações na actividade de enzimas antioxidantes e no conteúdo de antioxidantes não-enzimáticos. Demonstra-se que os dois órgãos apresentam respostas diferentes à exposição ao Al e que a capacidade de sobreviver em ambientes ricos em Al depende da eficácia da resposta antioxidante. Para além disso, a resposta do ciclo ascorbato-glutationas parece estar dependente do tipo de órgão, grau de tolerância e do tempo de exposição ao Al. No Capítulo III. 2 analisam-se os efeitos da exposição ao Al na fotossíntese. Verificou-se que o Al afecta negativamente a taxa fotossintética em ambos os genótipos, embora as alterações que o Al provoca nas trocas gasosas e no Ciclo de Calvin sejam dependentes do genótipo. Verificou-se também que os danos no genótipo sensível surgem mais cedo do que no genótipo tolerante, mas que ambos apresentam susceptibilidade ao Al após exposição de longo termo. Por fim, no Capítulo IV são apresentadas as conclusões da Tese de Doutoramento.

Integration of geochemical and biological modifications in mining areas: waters, sediments and diatoms

The development of mining activities over thousands of years in the region of Aljustrel is nowadays visible as a vast area of ore tailings, slag and host rocks of sulphides mineralization. The generation of acidic waters by the alteration of pyritic minerals - Acid Mine Drainage (AMD) - causes a significant impact on the river system both in the south of the village (Rib ª. Água Forte) and in the north of it (Rib ª. Água Azeda and Barranco do Farrobo), which is reflected in extremely low pH values (< 3) and high concentrations of As, Cd, Cu, Fe, Mn, Pb, Zn and sulphates. This study aimed to assess the environmental impacts extent, integrating geochemical (surface waters and stream sediments) and biological (diatoms) parameters. Three groups of sites were defined, based on sediments and water analysis, which integration with diatom data showed the same association of groups: Group 1- impacted, with acidic pH (1.9-5.1), high metal contents (0.4-1975 mg L-1) and Fe-Mg-sulphate waters, being metals more bioavailable in waters in cationic form (Me2+); mineralogically the sediments were characterized by phyllosilicates and sulphates/oxy-hydroxysulphate phases, easily solubilized, retaining a high amount of metals when precipitated; dominant taxon was Pinnularia aljustrelica (a new species); Group 2- slightly impacted, weak acid to neutral pH (5.0-6.8), metal contents not so high (0.2-25 mg L-1) and Fe-Mg-sulphate to Mg-chloride waters; dominant taxa were Brachysira neglectissima and Achnanthidium minutissimum; Group 3- unimpacted, alkaline pH (7.0-8.4), low metal contents (0-7 mg L-1) with Mg-chloride waters. In this group, metals were associated to the primary phases (e.g. sulphides), not so easily available; the existence of high chloride contents explained the presence of typical taxa of brackish/marine (e.g. Entomoneis paludosa) waters. Taxonomical aspects of the diatoms were studied (discovery of a new species: Pinnularia aljustrelica Luis, Almeida et Ector sp. nov.), as well as morphometric (size decrease of diatoms valves, as well as the appearance of deformed valves of Eunotia exigua in Group 1 and A. minutissimum in Group 2) and physiological (effective to assess the effects of metals/acidity in the photosynthetic efficiency through PAM Fluorometry) aspects. A study was carried out in an artificial river system (microcosm) that aimed to mimic Aljustrel’s extreme conditions in controlled laboratory conditions. The chronic effects of Fe, SO42- and acidity in field biofilms, inoculated in the artificial rivers, were evaluated as well as their contribution to the communities’ tolerance to metal toxicity, through acute tests with two metals (Cu and Zn). In general, the effects caused by low pH values and high concentrations of Fe and SO42- were reflected at the community level by the decrease in diversity, the predominance of acidophilic species, the decrease in photosynthetic efficiency and the increase of enzymatic (e.g. catalase, superoxide dismutase) and non-enzymatic activities (e.g. total glutathione and total phytochelatins). However, it was possible to verify that acidity performed a protective effect in the communities, upon Cu and Zn addition. A comparative study between Aljustrel mining area and New Brunswick mining area was carried out, both with similar mining and geological conditions, reflected in similar diatom communities in both mines, but in very different geographic and climatic areas.

The effects of chemicals in isopods : a multi-organizational evaluation

The global aim of this thesis was to evaluate and assess the effects of a pesticide (dimethoate) and a metal (nickel), as model chemicals, within different organization levels, starting at the detoxification pathways (enzymatic biomarkers) and energy costs associated (energy content quantification, energy consumption and CEA) along with the physiological alterations at the individual and population level (mortality), leading to a metabolomic analysis (using liquid 1H-NMR) and finally a gene expression analysis (transcriptome and RT-qPCR analysis). To better understand potential variations in response to stressors, abiotic factors were also assessed in terrestrial isopods such as temperature, soil moisture and UV radiation. The evaluation performed using biochemical biomarkers and energy related parameters showed that increases in temperature might negatively affect the organisms by generating oxidative stress. It also showed that this species is acclimated to environments with low soil moisture, and that in high moisture scenarios there was a short gap between the optimal and adverse conditions that led to increased mortality. As for UV-R, doses nowadays present have shown to induce significant negative impact on these organisms. The long-term exposure to dimethoate showed that besides the neurotoxicity resulting from acetylcholinesterase inhibition, this stressor also caused oxidative stress. This effect was observed for both concentrations used (recommended field dose application and a below EC50 value) and that its combination with different temperatures (20ºC and 25ºC) showed different response patterns. It was also observed that dimethoate’s degradation rate in soils was higher in the presence of isopods. In a similar study performed with nickel, oxidative stress was also observed. But, in the case of this stressor exposure, organisms showed a strategy where the energetic costs necessary for detoxification (biomarkers) seemed to be compensated by positive alterations in the energy related parameters. In this work we presented for the first time a metabolomic profile of terrestrial isopods exposed to stressors (dimethoate and niquel), since until the moment only a previous study was performed on a metabolomic evaluation in nonexposed isopods. In the first part of the study we identify 24 new metabolites that had not been described previously. On the second part of the study a metabolomic profile variation of abstract non-exposed organism throughout the exposure was presented and finally the metabolomic profile of organisms exposed to dimethoate and nickel. The exposure to nickel suggested alteration in growth, moult, haemocyanin and glutathione synthesis, energy pathways and in osmoregulation. As for the exposure to dimethoate alterations in osmoregulation, energy pathways, moult and neurotransmission were also suggested. In this work it was also presented the first full body transcriptome of a terrestrial isopod from the species Porcellionides pruinosus, which will complement the scarce information available for this group of organisms. This transcriptome also served as base for a RNA-Seq and a RT-qPCR analysis. The results of the RNA-Seq analysis performed in organisms exposed to nickel showed that this stressor negatively impacted at the genetic and epigenetic levels, in the trafficking, storage and elimination of metals, generates oxidative stress, inducing neurotoxicity and also affecting reproduction. These results were confirmed through RT-qPCR. As for the impact of dimethoate on these organisms it was only accessed through RT-qPCR and showed oxidative stress, an impact in neurotransmission, in epigenetic markers, DNA repair and cell cycle impairment. This study allowed the design of an Adverse Outcome Pathway draft that can be used further on for legislative purposes.