CD81 interacting proteins

Fertilization is a multistep and complex process culminating in the merge of gamete membranes, cytoplasmic unity and fusion of genome. CD81 is a tetraspanin protein that participates in sperm-oocyte interaction, being present at the oocyte surface. CD81 has also been implicated in other biological processes, however its specific function and molecular mechanisms of action remain to be elucidated. The interaction between CD81 and its binding partner proteins may underlie the CD81 involvement in a variety of cellular processes and modulate CD81/interactors specific functions. Interestingly, in a Yeast two Hybrid system previously performed in our lab, CD81 has emerged as a putative interactor of the Amyloid Precursor Protein (APP). In the work here described, bioinformatics analyses of CD81 interacting proteins were performed and the retrieved information used to construct a protein-protein interaction network, as well as to perform Gene Ontology enrichment analyses. CD81 expression was further evaluated in CHO, GC-1 and SH-SY5Y cell lines, and in human sperm cells. Additionally, its subcellular localization was analyzed in sperm cells and in the neuronal-like SH-SY5Y cell line. Subsequently, coimmunoprecipitation assays were performed in CHO and SH-SY5Y cells to attempt to prove the physical interaction between CD81 and APP. A functional interaction between these two proteins was accessed thought the analyses of the effects of CD81 overexpression on APP levels. A co-localization analysis of CD81 and some interactors proteins retrieved from the bioinformatics analyses, such as APP, AKT1 and cytoskeleton-related proteins, was also performed in sperm cells and in SH-SY5Y cells. The effects of CD81 in cytoskeleton remodeling was evaluated in SH-SY5Y cells through monitoring the effects of CD81 overexpression in actin and tubulin levels, and analyzing the colocalization between overexpressed CD81 and F-actin. Our results showed that CD81 is expressed in all cell lines tested, and also provided the first evidence of the presence of CD81 in human sperm cells. CD81 immunoreactivity was predominantly detected in the sperm head, including the acrosome membrane, and in the midpiece, where it co-localized with APP, as well as in the post-acrosomal region. Furthermore, CD81 co-localizes with APP in the plasma membrane and in cellular projections in SH-SY5Y cells, where CD81 overexpression has an influence on APP levels, also visible in CHO cells. The analysis of CD81 interacting proteins such as AKT1 and cytoskeletonrelated proteins showed that CD81 is involved in a variety of pathways that may underlie cytoskeleton remodeling events, related to processes such as sperm motility, cell migration and neuritogenesis. These results deepen our understanding on the functions of CD81 and some of its interactors in sperm and neuronal cells.

O efeito do stress celular na proteína precursora de amilóide de Alzheimer = The effect of cellular stress on the Alzheimer's amyloid precursor protein

A proteína precursora de amilóide de Alzheimer (APP) é um factor chave na doença de Alzheimer (AD). Essencialmente o processamento da APP resulta na produção de Abeta, o peptídeo tóxico depositado nas placas de amilóide dos indivíduos com AD. Ainda permanece por esclarecer se o processamento da APP é afectado sob condições de stress celular, potencialmente aumentando a quantidade de Abeta produzida. Além disso, o stress celular pode induzir alterações moleculares, associadas à AD, que podem representar marcadores moleculares úteis para o diagnóstico da AD. Com estas questões em mente, procurámos identificar alterações, em resposta ao stress celular, no processamento da APP e na expressão de outras proteínas. Nestes estudos de monitorização considerámos que a fosforilação proteica anormal e o stress oxidativo podem contribuir para a condição patológica. Assim, investigámos o processamento da APP dependente da fosforilação durante o stress celular. Os dados obtidos confirmam que a secreção da APP é reduzida em situações de stress, e que o efeito é idêntico em linhas celulares de tipo neuronal e não neuronal. Os resultados obtidos revelam que o PMA, mesmo em situações de stress (azida de sódio 1 mM) pode afectar o processamento da APP, aumentando a produção de sAPP (o fragmento secretado após o processamento de APP) que pode potencialmente reduzir a produção de Abeta. A hipótese de afectar a produção de Abeta dependente da fosforilação, que por sua vez pode ter relevância num quadro clínico, mantém-se mesmo em condições de stress. Os resultados revelaram que a indução de sAPP, após a adição de ésteres de forbol, ou ácido ocadeíco, em condições de stress não é idêntica. Em contraste, sob condições controlo, tanto os ésteres de forbol como o ácido ocadeíco produzem o mesmo efeito em termos da produção de sAPP. Aparentemente estas duas vias podem ser dissociadas em condições de stress, o que de algum modo pode reflectir processamento alterado da APP em condições adversas. Nas experiências em que se analisou a expressão de outros potenciais marcadores moleculares, foram detectadas alterações nos níveis de expressão de várias proteínas. Estes marcadores moleculares representam alvos interessantes para futura validação e potenciais candidatos para um diagnóstico molecular na AD. As proteínas já identificadas são importantes do ponto de vista da transdução de sinais, e incluem a PP1, a HSP70, a PARP e a própria APP.

Regulation of single exocytotic events by the cAMP signaling pathway

Permanece por esclarecer como a via de sinalização do cAMP modula a exocitose regulada. Os principais objetivos deste trabalho foram: i) avaliar o efeito do cAMP nos eventos exocitóticos, nas propriedades dos poros de fusão e na secreção hormonal; ii) perceber o impacto da sinalização por cAMP-HCN na exocitose e nas propriedades do poro de fusão; e iii) estudar as propriedades do poro de fusão na presença de um agente neurotóxico comum, como o alumínio. Lactotrofos, isolados a partir da hipófise anterior de ratos Wistar machos, foram usados como modelo celular. Os eventos unitários de fusão exocitótica e a prolactina (PRL) libertada foram avaliados, respetivamente, em ensaios eletrofisiológicos efectuados segundo a técnica de contacto hermético no modo sobre a célula aderida à pipeta porta-elétrodo e com recurso a métodos imunológicos de deteção. Os níveis intracelulares de cAMP foram aumentados por 3-isobutil-1-metilxantina (IMBX), forscolina e N6,2'-O-dibutiril adenosina- 3',5'-monofosfato cíclico (dbcAMP). A expressão dos canais HCN foi determinada por Western-blot, qRT-PCR e imunocitoquímica em combinação com microscopia confocal. Culturas primárias de lactotrofos foram também transfetadas com DNA plasmídico que codifica HCN2 juntamente com a proteína-verde-fluorescente e um agente farmacológico foi usado para avaliar o efeito de cAMP-HCN na exocitose. Observou-se que os lactotrofos responderam à forscolina e ao dbcAMP libertando PRL de um modo bifásico e dependente da concentração, uma vez que a secreção aumentou e diminuiu, respectivamente, na gama de baixas e altas concentrações. Os compostos que elevaram os níveis de cAMP aumentaram os eventos transientes e impediram a fusão completa. Além disso, o dbcAMP promoveu o aparecimento de eventos exocitóticos transientes de elevada periodicidade, cujos poros de fusão, de maior diâmetro, se mativeram abertos durante mais tempo. A expressão das quatro isoformas de HCN foi confirmada nos lactotrofos ao nível do mRNA e, tal como no coração, rim e hipófise, o mais abundante codifica a isoforma HCN2. Nos lactotrofos com sobre-expressão desta isoforma, o dbcAMP não só aumentou a frequência dos eventos transientes e a condutância dos poros, mas também a frequência dos eventos de fusão completa. Enquanto o bloqueador dos canais HCN, ZD7288, reduziu a frequência dos eventos transientes e de fusão completa desencadeados por dbcAMP e diminuiu o diâmetro dos poros de fusão. A simultânea diminuição da libertação de PRL, da frequência dos eventos transientes e do diâmetro dos poros de fusão representaram as principais alterações observados após pré-tratamento dos lactotrofos com concentração micromolar de alumínio. Em conclusão, os resultados demonstram que elevados níveis de cAMP reduzem a secreção de PRL devido à estabilização dos poros de fusão no estado de maior abertura. Além disso, a via de sinalização cAMP-HCN afecta a actividade exocitótica e modifica as propriedades dos poros de fusão, que parecem ser igualmente importantes na citotoxicidade induzida por alumínio.

Sinalização celular e a resposta a estrogénios do epitélio mamário

Estrogens, such as 17β-estradiol (E2) are essential for normal growth and differentiation of the mammary gland. There are two estrogen receptors (ERs), ERα and ERβ which are ligand activated transcription factors. ERα stimulates proliferation and is the single most powerful predictor of breast cancer prognosis and since 70% of breast cancers express ERα, strategies to block this receptor are the primary breast cancer treatment. Unlike ERα, the role of ERβ in breast cancer and its potential as alternative therapeutic target remains controversial, mainly due to the lack of correlation between results obtained in vitro and epidemiological studies. The aim of this thesis was to increase our understanding of the molecular and cellular mechanisms of estrogen signaling in normal and cancerous cells, in different cellular contexts and with focus on ERβ. In Paper I we characterized the effect of the flavone PD098059 - which is a commonly used MEK1 inhibitor - on activation of transcription by ERα and ERβ. We found that the estrogenic effect of PD098059 is dose dependent in concentrations ranging from 1 – 10 μM and that activation of transcription by ER is suppressed by the inhibitory effect of PD98059 on MEK1 at concentrations above 50 μM. In agreement with its flavone nature, PD098059 had a much stronger effect on ERβ than on ERα transcriptional activity. Therefore, use of this compound for the study of signalling events in cells expressing ER should be carefully considered. In Paper II we assessed the effect of ERβ agonists in vivo and administered under different conditions in vitro. In basal conditions, ERβ induced apoptosis; however, in vivo ERβ agonists stimulated proliferation and inhibited apoptosis. In vivo effects were reproduced in culture, by activation of MAPK/ERK½ pathway with epidermal growth factor or basement membrane extract. In addition, insulin signalling and PI3-K/AKT activation was necessary for stimulation of proliferation. These results suggest that the cellular context modulates ERβ activity. Manuscript presents preliminary work aimed at the set-up of a methodological strategy to isolate ERs and to identify interacting proteins in different cellular contexts and which could modulate the bi-phased effects of ERβ in cell growth. In conclusion, the studies presented in this thesis contribute to clarify the apparent contradictory information regarding ERβ function in normal and cancerous mammary epithelium and suggest that the cellular context should be considered when ERβ effects are studied.

Gestão de desempenho numa rede celular

A realização desta dissertação tem como principal objetivo a análise de indicadores chave de desempenho numa rede celular de terceira geração - Universal Mobile Telecommunication System (UMTS), bem como a aplicação de técnicas matemáticas de previsão como apoio ao respetivo planeamento e otimização. Para o efeito, foi inicialmente efetuado um estudo sobre a evolução das comunicações de uma forma generalista, até às redes de nova geração, abordando individualmente, as de voz, as de dados e as comunicações móveis, assim como, uma breve descrição das organizações envolvidas nestas mudanças. No seguimento do estudo inicial, dando enfoque à tecnologia UMTS, foram expostas as suas características, a sua estrutura e arquitetura. Foram ainda elaboradas, duas comparações, com base em diferentes parâmetros, uma com a tecnologia da geração anterior e outra, com a de última geração. Com base nos conhecimentos adquiridos em diferentes pesquisas, foram estudados, os indicadores chave de desempenho (KPIs), as técnicas de planeamento e otimização, apresentando propostas de prevenção e soluções para problemas existentes na rede.

Impact of natural and/or chemical stressors on the freeze-tolerant and euryhaline enchytraeid, Enchytraeus albidus

Rapid climatic changes are taking place in Arctic, subarctic and cold temperate regions, where predictions point to an increase in freeze-thaw events, changes in precipitation, evaporation and salinity patterns. Climate change may therefore result in large impacts in ecosystem functioning and dynamics, especially in the presence of contaminants due to intense anthropogenic activities. Even though multiple stress approaches have received increasing interest in the last decades, the number of such studies is limited. In particular, knowledge on the effect of freezethaw events and salinity fluctuations on ecotoxicology of soil invertebrates is lacking, especially important when considering supralittoral species. Therefore, the aim of this thesis was to investigate the effects of low temperature and salinity fluctuations, singly and in combination with contaminants, in the freeze-tolerant and euryhaline enchytraeid Enchytraeus albidus. The assessment of population level endpoints (survival and reproduction), along with physiological and biochemical parameters such as levels of cryoprotectants, ice/water content, oxidative stress biomarkers, cellular energy allocation, and tissue concentration of chemicals (when applied), provided new and valuable knowledge on the effects of selected physical and chemical stressors in E. albidus, and allowed the understanding of adjustments in the primary response mechanisms that enable worms to maintain homeostasis and survival in harsh environments such as polar and temperate-cold regions. The presence of moderate levels of salinity significantly increased freeze-tolerance (mainly evaluated as survival, cryoprotection and ice fraction) and reproduction of E. albidus. Moreover, it contributed to the readjustments of cryoprotectant levels, restoration of antioxidant levels and changed singnificantly the effect and uptake of chemicals (copper cadmium, carbendazim and 4-nonylphenol). Temperature fluctuations (simulated as daily freeze-thaw cycles, between -2ºC and -4ºC) caused substancial negative effect on survival of worms previsouly exposed to non-lethal concentrations of 4-nonylphenol, as compared with constant freezing (-4ºC) and control temperature (2ºC). The decrease in cryoprotectants, increase in energy consumption and the highest concentration of 4-nonylphenol in the tissues have highlighted the high energy requirements and level of toxicity experienced by worms exposed to the combined effect of contaminants and freezing-thawing events. The findings reported on this thesis demonstrate that natural (physical) and chemical stressors, singly or in combination, may alter the dynamics of E. albidus, affecting not only their survival and reproduction (and consequent presence/distribution) but also their physiological and biochemical adaptations. These alterations may lead to severe consequences for the functioning of the ecosystems along the Arctic, subarctic and cold temperate regions, where they play an important role for decomposition of dead organic matter. This thesis provides a scientific basis for improving the setting of safety factors for natural soil ecosystems, and to underline the integration of similar investigations in ecotoxicology, and eventually in risk assessment of contaminants.