Molecular study of cell degeneration and evolution induced by mRNA mistranslation

As proteínas existentes nas células são produzidas pelo mecanismo de tradução do mRNA, no qual a informação genética contida nos genes é descodificada em cadeias polipeptídicas. O código genético, que define as regras de descodificação do genoma, minimiza os erros de tradução do mRNA, garantindo a síntese de proteínas com elevada fidelidade. Esta é essencial para a estabilidade do proteoma e para a manutenção e funcionamento dos processos celulares. Em condições fisiológicas normais, os erros da tradução do mRNA ocorrem com frequências que variam de 10-3 a 10-5 erros por codão descodificado. Situações que aumentam este erro basal geralmente estão associadas ao envelhecimento, stresse e a doenças; no entanto, em certos organismos o código genético é traduzido naturalmente com elevado erro, indicando que a síntese de proteínas aberrantes pode de algum modo ser vantajosa. A fim de estudar a resposta celular aos erros de tradução do mRNA, construímos leveduras que incorporam serina no proteoma em resposta a um codão de leucina, usando a expressão constitutiva de um tRNASer mutante. Este fenómeno genético artificial provocou uma forte diminuição da esporulação, da viabilidade e da eficiência de mating, afectando imensamente a reprodução sexual da levedura. Observou-se também uma grande heterogeneidade no tamanho e na forma das células e elevada instabilidade genómica, com o aparecimento de populações poliplóides e aneuplóides. No sentido de clarificar as bases celulares e moleculares daqueles fenótipos e compreender melhor a biologia do erro de tradução do mRNA, construímos também células de levedura que inserem serina em resposta a um codão de leucina de modo indutível e controlado. Utilizaram-se perfis de mRNA total e de mRNA associado a polissomas para elucidar a resposta celular ao erro de tradução do mRNA. Observou-se a indução de genes envolvidos na resposta ao stresse geral, stresse oxidativo e na unfolded protein response (UPR). Um aumento significativo de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e um forte impacto negativo na capacidade das células pós-mitóticas re-iniciarem o crescimento foram também observados. Este fenótipo de perda de viabilidade celular foi resgatado por scavangers de ROS, indicando que o stresse oxidativo é a principal causa de morte celular causada pelos erros de tradução. Este estudo levanta a hipótese de que o stresse oxidativo e a acumulação de ROS, ao invés do colapso súbito do proteoma, são as principais causas da degeneração celular e das doenças humanas associadas aos erros de tradução do genoma. ABSTRACT: Proteins are synthesized through the mechanism of translation, which uses the genetic code to transform the nucleic acids based information of the genome into the amino acids based information of the proteome. The genetic code evolved in such a manner that translational errors are kept to a minimum and even when they occur their impact is minimized by similar chemical properties of the amino acids. Protein synthesis fidelity is essential for proteome stability and for functional maintenance of cellular processes. Indeed, under normal physiological conditions, mistranslation occurs at frequencies that range from 10-3 to 10-5 errors per codon decoded. Situations where this basal error frequency increases are usually associated to aging and disease. However, there are some organisms where genetic code errors occur naturally at high level, suggesting that mRNA mistranslation can somehow be beneficial. In order to study the cellular response to mRNA mistranslation, we have engineered single codon mistranslation in yeast cells, using constitutive expression of mutant tRNASer genes. These mistranslating strains inserted serines at leucine-CUG sites on a proteome wide scale due to competition between the wild type tRNALeu with the mutant tRNASer. Such mistranslation event decreased yeast sporulation, viability and mating efficiencies sharply and affected sexual reproduction strongly. High heterogeneity in cell size and shape and high instability in the genome were also observed, with the appearance of some polyploid or aneuploid cell populations. To further study the cellular and molecular basis of those phenotypes and the biology of mRNA mistranslation, we have also engineered inducible mRNA misreading in yeast and used total mRNA and polysome associated mRNA profiling to determine whether codon misreading affects gene expression. Induced mistranslation up-regulated genes involved in the general stress response, oxidative stress and in the unfolded protein response (UPR). A significant increase in reactive oxygen species (ROS) and a strong negative impact on the capacity of post-mitotic cells to re-initiate growth in fresh media were also observed. This cell viability phenotype was rescued by scavengers of ROS, indicating that oxidative stress is the main cause of cell death caused by mRNA mistranslation. This study provides strong support for the hypothesis that oxidative stress and ROS accumulation, rather than sudden proteome collapse or major proteome disruption, are the main cause of the cellular degeneration observed in human diseases associated mRNA mistranslation.

Cellular responses to genome mistranslation

Low level protein synthesis errors can have profound effects on normal cell physiology and disease development, namely neurodegeneration, cancer and aging. The biology of errors introduced into proteins during mRNA translation, herein referred as mistranslation, is not yet fully understood. In order to shed new light into this biological phenomenon, we have engineered constitutive codon misreading in S. cerevisiae, using a mutant tRNA that misreads leucine CUG codons as serine, representing a 240 fold increase in mRNA translational error relative to typical physiological error (0.0001%). Our studies show that mistranslation induces autophagic activity, increases accumulation of insoluble proteins, production of reactive oxygen species, and morphological disruption of the mitochondrial network. Mistranslation also up-regulates the expression of the longevity gene PNC1, which is a regulator of Sir2p deacetylase activity. We show here that both PNC1 and SIR2 are involved in the regulation of autophagy induced by mistranslation, but not by starvation-induced autophagy. Mistranslation leads to P-body but not stress-granule assembly, down-regulates the expression of ribosomal protein genes and increases slightly the selective degradation of ribosomes (ribophagy). The study also indicates that yeast cells are much more resistant to mistranslation than expected and highlights the importance of autophagy in the cellular response to mistranslation. Morpho-functional alterations of the mitochondrial network are the most visible phenotype of mistranslation. Since most of the basic cellular processes are conserved between yeast and humans, this study reinforces the importance of yeast as a model system to study mistranslation and suggests that oxidative stress and accumulation of misfolded proteins arising from aberrant protein synthesis are important causes of the cellular degeneration observed in human diseases associated to mRNA mistranslation.

The role of environmental stress on protein synthesis fidelity

Estudos recentes estabelecem uma ligação entre erros na tradução do mRNA e cancro, envelhecimento e neurodegeneração. RNAs de transferência mutantes que introduzem aminoácidos em locais errados nas proteínas aumentam a produção de espécies reactivas de oxigénio e a expressão de genes que regulam autofagia, ribofagia, degradação de proteínas não-funcionais e protecção contra o stress oxidativo. Erros na tradução do mRNA estão portanto relacionados com stress proteotóxico. Sabe-se agora que o mecanismo de toxicidade do crómio está associado à diminuição da fidelidade de tradução e à agregação de proteínas com malformações que destabilizam a sua estrutura terciária. Desta forma, é possível que os efeitos do stress ambiental ao nível da degeneração celular possam estar relacionados com a alteração da integridade da maquinaria da tradução. Neste estudo procedeu-se a uma avaliação alargada do impacto do stress ambiental na fidelidade da síntese de proteínas, utilizando S. cerevisiae como um sistema modelo. Para isso recorreu-se a repórteres policistrónicos de luciferase que permitiram quantificar especificamente a supressão de codões de terminação e o erro na leitura do codão AUG em células exposta a concentações não letais de metais pesados, etanol, cafeína e H2O2. Os resultados sugerem que a maquinaria de tradução é na generalidade muito resistente ao stress ambiental, devido a uma conjugação de mecanismos de homeostase que muito eficientemente antagonizam o impacto negativo dos erros de tradução. A nossa abordagem quantitativa permitiu-nos a identificar genes regulados por uma resposta programada ao stress ambiental que são também essenciais para mitigar a ocorrência de erros de tradução, nomeadamente, HSP12, HSP104 e RPN4. A exposição prolongada ao stress ambiental conduz à saturação dos mecanismos de homeostase, contribuindo para a acumulação de proteínas contendo erros de tradução e diminuindo a disponibilidade de proteínas funcionais directamente envolvidas na manutenção da fidelidade de tradução e integridade celular. Ao contrário de outras Hsps, a Hsp12p adopta normalmente uma localização membranar em condições de stress, que pode modular a fluidez e estabilidade membranar, sugerindo que a membrana plasmática é um alvo preferencial da perda de fidelidade da tradução. Para melhor compreender as respostas celulares aos erros de tradução, células contendo deleções em genes codificadores das Hsps foram transformadas com tRNAs mutantes que introduzem alterações no proteoma. Os nossos resultados demonstram que para além da resposta geral ao stress, estes tRNAs induzem alterações a nível do metabolismo celular e um aumento de aminoacilação com Metionina em vários tRNAs, sugerindo um mecanismo de protecção contra espécies reactivas de oxigénio. Em conclusão, este estudo sugere um papel para os erros de tradução na gestão de recursos energéticos e na adaptação das células a ambientes desfavoráveis.

Genetic profiling of ApoE in dementia

A demência é uma das principais causas de incapacidade entre os idosos, afetando mais de 36 milhões de pessoas em todo o mundo. É caracterizada pela deterioração progressiva das funções cognitivas, resultando em dificuldades no desempenho das atividades diárias do indivíduo. A idade de aparecimento dos sintomas, bem como a sua taxa de progressão, são variáveis entre a maior parte das demências, sendo estas geralmente caracterizadas por uma natureza progressiva, aumentando de gravidade ao longo do tempo. Entre os tipos mais frequentes de demência encontram-se a Doença de Alzheimer (DA), Demência Vascular, Demência de Corpos de Lewy e Demência Frontotemporal. O diagnóstico diferencial das demências é realizado tipicamente por testes neuro-psicológicos (para a exclusão de outras demências) e por exames imagiológicos. Contudo, muitos dos sintomas clínicos característicos podem sobrepor-se entre os diversos tipos de demência, o que pode constituir um problema devido a falta de especificidade e erros de diagnóstico. A compreensão dos fatores de risco ambientais e genéticos que podem modular o aparecimento e/ou progressão de doenças abre novas perspetivas relativamente à gestão destas neuropatologias. O gene da apolipoproteína E (ApoE) é reconhecido como o maior fator de risco na demência, desempenhando um papel central em particular no desenvolvimento da DA, sendo que os portadores do alelo ε4 são mais suscetíveis para a doença. Além disso, possíveis associações foram também propostas entre este gene e outras doenças neurológicas, sendo no entanto estes dados ainda controversos. Assim, o objetivo principal deste trabalho consistiu em determinar as frequências alélicas e genotípicas do gene ApoE num grupo de estudo piloto de pacientes com demência na região de Aveiro. Este grupo foi subdividido com base no diagnóstico neuroquímico, no qual foram avaliados os níveis de Aβ1-42, Tau-total e fosfo-Tau 181 no líquido cefalorraquidiano dos pacientes. Como resultado, observou-se que o alelo ε3 foi o mais frequente no grupo total, independentemente do tipo de patologia, e que o alelo ε2 foi o menos comum. O alelo ε4 foi de facto mais frequente em pacientes com DA do que em pacientes com outras neuropatologias, o que está de acordo com a relação proposta por outros autores. Adicionalmente, foi possível verificar que a frequência deste alelo nos pacientes com patologia amilóide é semelhante à observada no grupo DA, sugerindo um papel relevante para o ApoE no metabolismo e acumulação cerebral do Aβ. Consequentemente, estes indivíduos podem ter uma maior suscetibilidade para o desenvolvimento de DA no futuro. Deste modo, os nossos dados corroboram a ideia de que o alelo ε4 é um forte fator de risco para a DA e que deve ser considerado como um teste genético relevante que pode contribuir para o diagnóstico clínico da demência.

Characterization of proteotoxic stress in zebrafish

A fidelidade da síntese proteica é fundamental para a estabilidade do proteoma e para a homeostasia celular. Em condições fisiológicas normais as células têm uma taxa de erro basal associada e esta muitas vezes aumenta com o envelhecimento e doença. Problemas na síntese das proteínas estão associados a várias doenças humanas e aos processos de envelhecimento. De facto, a incorporação de erros nas proteínas devido a tRNAs carregados pelas aminoacil-tRNA sintetases com o amino ácido errado causa doenças neurodegenerativas em humanos e ratos. Ainda não é claro como é que estas doenças se desenvolvem e se são uma consequência directa da disrupção do proteoma ou se são o resultado da toxicidade produzida pela acúmulação de proteínas mal traduzidas ao nível do ribossoma. Para elucidar como é que as células eucarióticas lidam com proteínas aberrantes e agregados proteicos (stress proteotóxico) desenvolvemos uma estratégia para destabilizar o proteoma. Para isso estabelecemos um sistema de erros de tradução em embriões de peixe zebra que assenta em tRNAs mutantes capazes de incorporar erradamente serina nas proteínas. As proteínas produzidas neste sistema despoletam as vias de resposta ao stress, nomeadamente a via da ubiquitina-proteassoma (UPP – “ubiquitin protesome pathway”) e a via do retículo endoplasmático (UPR – “unfolded protein response”). O stress proteotóxico gerado pelos erros de tradução altera a expressão génica e perfis de expressão de miRNAs, o desenvolvimento embrionário e viabilidade, aumenta a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), leva ainda à acumulação de agregados proteicos e à disfunção mitocondrial. As malformações embrionárias e fenótipos de viabilidade que observámos foram revertidos por antioxidantes, o que sugere que os ROS desempenham papéis importantes nos fenótipos degenerativos celulares induzidos pela produção de proteínas aberrantes e agregação proteica. Estabelecemos ainda uma linha de peixe zebra transgénica para o estudo do stress proteotóxico. Este trabalho mostra que a destabilização do proteoma em embriões de peixe zebra com tRNAs mutantes é uma boa metodologia para estudar a biologia do stress proteotóxico visto que permite a agregação controlada do proteoma, mimetizando os processos de agregação de proteínas que ocorrem naturalmente durante o envelhecimento e em doenças conformacionais humanas.