Endocrine disruption in the terrestrial isopod porcellio scaber

Nas últimas décadas tem-se assistido a uma preocupação crescente relativamente às possíveis consequências da exposição a compostosxenóbioticos capazes de modular ou causar disrupção do sistema endócrino, os denominados Compostos Disruptores Endócrinos (CDEs). A maioria dos estudos efectuados tem-se centrado principalmente nos efeitos dos CDEs em vertebrados, enquanto que os seus efeitos em invertebrados têmsido negligenciados, embora este grupo represente mais de 95% de todas asespécies animais. Isópodes como o Porcellio scaber, combinam características associadas às mudas e aos processos reprodutivos mediados por mecanismos endócrinosconhecidos com um modo de vida terrestre, tornando-os potenciais espécies sentinela para estudos de disrupção endócrina (DE) em ambientes terrestres. Neste estudo, isópodes machos adultos, machos e fêmeas juvenis e casais foram expostos a concentrações crescentes dedois CDEs, vinclozolina (Vz) e bisfenol A (BPA). Testou-se a hipótese nula que a Vz e o BPA não interferem com o desenvolvimento e reprodução deste isópode terrestre. Foi investigadaa possível ligação entre os efeitos causados pelos compostos propostos e DE assim como a ligação a outros potenciais mecanismos de toxicidade.Parâmetros como concentração de 20-hidroxiecdisona (20E), muda, crescimento, rácios sexuais ediversos parâmetros reprodutivos foram estudados. Adicionalmente, de modo a estudar os alvos moleculares destes tóxicos, analisou-se a expressão proteica do intestino, hepatopâncreas e testículos do isópode após exposição aos químicos. Os resultados demonstram que a Vz e o BPA estimulam o aumento dos níveis de 20E de um modo dependente da dose. Excepção feita para a concentração mais baixa de BPA testada (10 mg/kg solo), para a qual concentrações significativamente mais altas de 20E foram determinadas, sugerindo a ocorrência dos “efeitos de baixas doses típicos de DE” já demonstrados por outros autores. O BPA também distorceu o rácio sexual favorecendo asfêmeas na concentração mais baixa. A mortalidade devido à ecdise incompleta foi relacionada com o hiper-ecdisonismo nas concentrações mais elevadas de Vz. Mais ainda, a Vz tende a atrasar a muda e o BPA a induzi-la. Não obstante, ambos os compostos provocam toxicidade no desenvolvimento,uma vez que foi encontrada uma diminuição generalizada nos parâmetros de crescimento. Os juvenis mostraram ser mais sensíveis à exposição aos tóxicos que os adultos. Estes compostos provocaram ainda toxicidade reprodutiva, com um decréscimo generalizado do “output” reprodutivo. A toxicidadecausada pelos ecdisteróides e o seu papel na síntese de vitelogenina são alguns dos factores chave que poderão influenciar negativamente a reprodução.A Vz e o BPA afectaram a expressão de proteínas envolvidas nometabolismo energético e induziram várias respostas de stress. Interferiram ainda com proteínas intimamente ligadas com o sucesso reprodutivo. Conclui-se assim,que ambos os CDEs propostos provocam toxicidade nodesenvolvimento e na reprodução de P. scaber, tendo sido evidenciada umaligação a DE. Alvos moleculares de natureza não-endócrina foram também revelados, através da expressão diferencial de algumas proteínaspreviamente descritas para invertebrados aquáticos e mesmo alguns vertebrados.

Nucella lapillus: imposex transcriptome analysis and phenotypic plasticity

O conhecimento de mecanismos de genómica funcional tem sido maioritariamente adquirido pela utilização de organismos modelo que são mantidos em condições laboratoriais. Contudo, estes organismos não reflectem as respostas a alterações ambientais. Por outro lado, várias espécies, ecologicamente bem estudadas, reflectem bem as interacções entre genes e ambiente mas que, das quais não existem recursos genéticos disponíveis. O imposex, caracterizado pela superimposição de caracteres sexuais masculinos em fêmeas, é induzido pelo tributilestanho (TBT) e trifenilestanho (TPT) e representa um dos melhores exemplos de disrupção endócrina com causas antropogénicas no ambiente aquático. Com o intuito de elucidar as bases moleculares deste fenómeno, procedeu-se à combinação das metodologias de pirosequenciação (sequenciação 454 da Roche) e microarrays (Agilent 4*180K) de forma a contribuir para um melhor conhecimento desta interacção gene-ambiente no gastrópode Nucella lapillus, uma espécie sentinela para imposex. O trancriptoma de N. lapillus foi sequenciado, reconstruído e anotado e posteriormente utilizado para a produção de um “array” de nucleótidos. Este array foi então utilizado para explorar níveis de expressão génica em resposta à contaminação por TBT. Os resultados obtidos confirmaram as hipóteses anteriormente propostas (esteróidica, neuroendócrina, retinóica) e adicionalmente revelou a existência de potenciais novos mecanismos envolvidos no fenómeno imposex. Evidência para alvos moleculares de disrupção endócrina não relacionados com funções reprodutoras, tais como, sistema imunitário, apoptose e supressores de tumores, foram identificados. Apesar disso, tendo em conta a forte componente reprodutiva do imposex, esta componente funcional foi a mais explorada. Assim, factores de transcrição e receptores nucleares lipofílicos, funções mitocondriais e actividade de transporte celular envolvidos na diferenciação de géneros estão na base de potenciais novos mecanismos associados ao imposex em N. lapillus. Em particular, foi identificado como estando sobre-expresso, um possível homólogo do receptor nuclear “peroxisome proliferator-activated receptor gamma” (PPARγ), cuja função na indução de imposex foi confirmada experimentalmente in vivo após injecção dos animais com Rosiglitazone, um conhecido ligando de PPARγ em vertebrados. De uma forma geral, os resultados obtidos mostram que o fenómeno imposex é um mecanismo complexo, que possivelmente envolve a cascata de sinalização envolvendo o receptor retinoid X (RXR):PPARγ “heterodimer” que, até à data não foi descrito em invertebrados. Adicionalmente, os resultados obtidos apontam para alguma conservação de mecanismos de acção envolvidos na disrupção endócrina em invertebrados e vertebrados. Finalmente, a informação molecular produzida e as ferramentas moleculares desenvolvidas contribuem de forma significativa para um melhor conhecimento do fenómeno imposex e constituem importantes recursos para a continuação da investigação deste fenómeno e, adicionalmente, poderão vir a ser aplicadas no estudo de outras respostas a alterações ambientais usando N. lapillus como organismo modelo. Neste sentido, N. lapillus foi também utilizada para explorar a adaptação na morfologia da concha em resposta a alterações naturais induzidas por acção das ondas e pelo risco de predação por caranguejos. O contributo da componente genética, plástica e da sua interacção para a expressão fenotípica é crucial para compreender a evolução de caracteres adaptativos a ambientes heterogéneos. A contribuição destes factores na morfologia da concha de N. lapillus foi explorada recorrendo a transplantes recíprocos e experiências laboratoriais em ambiente comum (com e sem influência de predação) e complementada com análises genéticas, utilizando juvenis provenientes de locais representativos de costas expostas e abrigadas da acção das ondas. As populações estudadas são diferentes geneticamente mas possuem o mesmo cariótipo. Adicionalmente, análises morfométricas revelaram plasticidade da morfologia da concha em ambas as direcções dos transplantes recíprocos e também a retenção parcial, em ambiente comum, da forma da concha nos indivíduos da F2, indicando uma correlação positiva (co-gradiente) entre heritabilidade e plasticidade. A presença de estímulos de predação por caranguejos estimulou a produção de conchas com labros mais grossos, de forma mais evidente em animais recolhidos de costas expostas e também provocou alterações na forma da concha em animais desta proveniência. Estes dados sugerem contra-gradiente em alterações provocadas por predação na morfologia da concha, na produção de labros mais grossos e em níveis de crescimento. O estudo das interacções gene-ambiente descritas acima demonstram a actual possibilidade de produzir recursos e conhecimento genómico numa espécie bem caracterizada ecologicamente mas com limitada informação genómica. Estes recursos permitem um maior conhecimento biológico desta espécie e abrirão novas oportunidades de investigação, que até aqui seriam impossíveis de abordar.

Toxicity assessment of essential metals in aquatic detritivores

Os contaminantes provenientes quer de fontes naturais quer como consequência da atividade humana, têm contribuído para a degradação dos ecossistemas aquáticos. Entre estes encontram-se os metais que podem, ou não ser essenciais mediante o papel que desempenham no metabolismo dos organismos. O cobre e o zinco são exemplos de metais essenciais, contudo quando atingem concentrações elevadas podem tornar-se tóxicos. Os detritívoros aquáticos desempenham um papel fundamental na decomposição da matéria orgânica, alimentando-se de carcaças e partes de plantas que caem nos cursos de água. Assim, estes organismos permitem que o ciclo dos nutrientes se complete e servem como elo de ligação entre todos os grupos funcionais do ecossistema mantendo o seu equilíbrio estrutural e funcional. Sendo a matéria orgânica a sua principal fonte de energia estão sujeitos à contaminação existente no meio, pelo que é de todo o interesse proceder-se à avaliação dos efeitos da toxicidade de metais nestes organismos. Uma vez que as diferenças comportamentais consequentes desta exposição podem originar variações na densidade e diversidade, o que se refletirá a nível das comunidades, originando alterações na estrutura e funcionamento do ecossistema. Tendo em vista a avaliação dos efeitos da contaminação por metais em detritívoros, o principal objetivo deste trabalho foi comparar a sensibilidade a metais essenciais de dois detritivoros aquáticos, o camarão Atyaephyra desmarestii e o anfípode Echinogammarus meridionalis. Para tal, avaliaram-se os efeitos do cobre e do zinco a diferentes níveis de organização biológica. Primeiro, foram determinadas as preferências alimentares de A. desmarestii e E. meridionalis considerando tanto a área das folhas como a contaminação por metais das folhas. Em seguida, avaliaram-se os efeitos do cobre e do zinco na sobrevivência e inibição alimentar de ambas as espécies. Finalmente, avaliaram-se os efeitos destes mesmos metais a nível bioquímico utilizando uma bateria de biomarcadores que incluiu enzimas de stresse oxidativo, o sistema de defesa antioxidante e as colinesterases. Ambos os organismos não mostraram preferência em relação a folhas de área diferente. A presença de uma maior ou menor concentração de metais essenciais no alimento não teve qualquer influência na sua escolha pelo alimento (contaminado ou não). Os ensaios agudos de cobre e zinco mostraram que o cobre é mais tóxico para ambas as espécies do que o zinco. O camarão demonstrou ser mais sensível ao zinco que o anfípode, tendo este sido mais sensível ao cobre ( CL50 do cobre para A. desmarestii foi de 0,128 mg.l-1 e o de E. meridionalis foi de 0,050 mg.l-1; os valores correspondentes para o zinco foram 7,951 e 11,860 mg.l-1, respectivamente. Em relação aos efeitos subletais, o cobre teve efeitos notórios na taxa de alimentação de E. meridionalis, mas não afectou a de A. desmarestii. No que diz respeito à exposição ao zinco, ambas as espécies parecem apresentar tendência para inibir a alimentação. A caracterização das colinesterases revelou que a principal forma presente em ambas as espécies é a acetilcolinesterase, a qual que não foi afetada pela presença dos metais, no caso do camarão, mas parece ser inibida pelo zinco no caso do anfípode. O cobre inibiu o sistema de defesa enzimático de ambas as espécies, sem sinais de danos lipídicos. Para além disto, inibiu uma das enzimas antioxidantes (GPx) do anfípode. Apesar de não ter ocorrido dano lipídico após exposição ao cobre, observou-se um ligeiro aumento dos níveis das LPO, o que pode ser indicativo de uma potencial existência de dano oxidativo, como resultado da falha do sistema de defesa antioxidante. Por outro lado, o zinco induziu o sistema de defesa em E. meriodionalis prevenindo o dano lipídico. Enquanto em A. desmarestii o sistema enzimático antioxidante não respondeu, tendo ocorrido dano celular oxidativo considerando-se, assim, que o sistema de defesa antioxidante do camarão pode ser comprometido por exposição a metais. Ainda que os danos celulares oxidativos tivessem ocorrido a baixas concentrações de zinco. A exposição a este metal também induziu a actividade da GST de E. meriodionalis. Considerando que a taxa de alimentação foi severamente reduzida no caso deste organismo, o zinco parece ser o metal cuja concentração no ecossistema requer maior atenção. Integrando as respostas dos biomarcadores parece também evidente que A. desmarestii responde de uma maneira geral a maiores concentrações dos dois metais, enquanto a resposta de E. meridionalis ocorre a concentrações inferiores. Pelo que, E. meridionalis parece ser mais sensível ao nível bioquímico. Neste trabalho, os dois detritívoros, com ligeiras diferenças no modo como utilizam a matéria orgânica disponível, apresentam diferenças na sensibilidade aos metais essenciais a vários níveis de organização biológica, sendo o zinco o metal que poderá causar maior preocupação a nível bioquímico, enquanto o cobre parece ser o mais tóxico ao nível do organismo, causando mortalidade a concentrações mais baixas.

Silver nanoparticles flow in an aquatic trophic chain

Silver nanoparticles (AgNP) have been produced and applied in a variety of products ranging from personal care products to food package containers, clothing and medicine utilities. The antimicrobial function of AgNP makes it very useful to be applied for such purposes. Silver (Ag) is a non-essential metal for organisms, and it has been historically present in the environment at low concentrations. Those concentrations of silver increased in the last century due to the use of Ag in the photographic industry and lately are expected to increase due to the use of AgNPs in consumer products. The presence of AgNP in the aquatic environment may pose a risk for aquatic species, and the effects can vary from lethal to sublethal effects. Moreover, the contact of aquatic organisms with AgNP may not cause immediately the death of individuals but it can be accumulated inside the animals and consequently transferred within the food chain. Considering this, the objective of this work was to study the transfer of silver nanoparticles in comparison to silver ions, which was used as silver nitrate, within an aquatic food chain model. To achieve this goal, this study was divided into four steps: the toxicity assessment of AgNP and AgNO3 to aquatic test-species, the bioaccumulation assessment of AgNP and AgNO3 by Pseudokirchneriella subcapitata and Daphnia magna under different exposure scenarios, and finally the evaluation of the trophic transfer of Ag through an experimental design that included the goldfish Carassius auratus in a model trophic chain in which all the species were exposed to the worse-case scenario. We observed that the bioconcentration of Ag by P. subcapitata is mainly driven by ionic silver, and that algae cannot internalize these AgNPs, but it does internalizes dissolved Ag. Daphnia magna was exposed to AgNP and AgNO3 through different exposure routes: water, food and both water and food. The worse-case scenario for Daphnia Ag bioaccumulation was by the joint exposure of contaminated water and food, showing that Ag body burdens were higher for AgNPs than for AgNO3. Finally, by exposing C. auratus for 10 days through contaminated water and food (supplied as D. magna), with another 7 days of depuration phase, it was concluded that the 10 days of exposure were not enough for fish to reach a plateau on Ag internal concentration, and neither the 7 days of elimination were sufficient to cause total depuration of the accumulated Ag. Moreover, a higher concentration of Ag was found in the intestine of fish when compared with other organs, and the elimination rate constant of AgNP in the intestine was very low. Although a potential for trophic transfer of AgNP cannot be suggested based in the data acquired in this study, there is still a potential environmental risk for aquatic species.