Molecular reconstruction of a genetic code alteration

The genetic code establishes the rules that govern gene translation into proteins. It was established more than 3.5 billion years ago and it is one of the most conserved features of life. Despite this, several alterations to the standard genetic code have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes, namely in the fungal CTG clade where a unique seryl transfer RNA (tRNACAG Ser) decodes leucine CUG codons as serine. This tRNACAG Ser appeared 272±25 million years ago through insertion of an adenosine in the middle position of the anticodon of a tRNACGA Ser gene, which changed its anticodon from 5´-CGA-3´ to 5´-CAG-3´. This most dramatic genetic event restructured the proteome of the CTG clade species, but it is not yet clear how and why such deleterious genetic event was selected and became fixed in those fungal genomes. In this study we have attempted to shed new light on the evolution of this fungal genetic code alteration by reconstructing its evolutionary pathway in vivo in the yeast Saccharomyces cerevisiae. For this, we have expressed wild type and mutant versions of the C. albicans tRNACGA Ser gene into S. cerevisiae and evaluated the impact of the mutant tRNACGA Ser on fitness, tRNA stability, translation efficiency and aminoacylation kinetics. Our data demonstrate that these mutants are expressed and misincorporate Ser at CUGs, but their expression is repressed through an unknown molecular mechanism. We further demonstrate, using in vivo forced evolution methodologies, that the tRNACAG Ser can be easily inactivated through natural mutations that prevent its recognition by the seryl-tRNA synthetase. The overall data show that repression of expression of the mistranslating tRNACAG Ser played a critical role on the evolution of CUG reassignment from Leu to Ser. In order to better understand the evolution of natural genetic code alterations, we have also engineered partial reassignment of various codons in yeast. The data confirmed that genetic code ambiguity affects fitness, induces protein aggregation, interferes with the cell cycle and results in nuclear and morphologic alterations, genome instability and gene expression deregulation. Interestingly, it also generates phenotypic variability and phenotypes that confer growth advantages in certain environmental conditions. This study provides strong evidence for direct and critical roles of the environment on the evolution of genetic code alterations.

Níveis de actividade e participação das pessoas com afasia: desenvolvimento de instrumentos de avaliação portugueses

A International Classification of Functioning, Disability and Health (ICF) (WHO 2001) realça a necessidade dos profissionais de saúde considerarem, na intervenção que realizam com a pessoa, as possíveis consequências de uma doença em diferentes domínios, nomeadamente nas suas Funções e Estruturas do Corpo, nas suas Actividades diárias e na sua Participação em situações da vida real. Realça ainda a possível interferência dos Factores Contextuais neste processo. Em Portugal, os instrumentos existentes utilizados pelos terapeutas da fala (TFs) na sua prática clínica com pessoas com afasia (PCAs), não permitem avaliar estes domínios, o que poderá limitar uma intervenção mais alargada, que integre estas directivas. Pretendeu-se com este estudo efectuar a tradução e adaptação à língua portuguesa do Communication Disability Profile (CDP) (Swinburn and Byng 2006) e do Participation Objective Participation Subjective (POPS) (Brown, Dijkers et al. 2004), ambos desenvolvidos à luz da ICF, de modo a apetrechar os TFs do país, com instrumentos de avaliação que lhes permitam abordar os diferentes domínios referidos. Pretendeu-se ainda conhecer as reais necessidades de PCAs portuguesas, ou seja, efectuar um levantamento das consequências dos AVCs e da afasia na sua vida diária e verificar de que modo os instrumentos escolhidos permitem identificar com precisão estas necessidades. Foram envolvidos três grupos distintos de participantes, nomeadamente catorze PCAs, catorze familiares e amigos (F/A) e dez TFs, consultados em três fases distintas. Recorreu-se ao uso de diferentes métodos e instrumentos de recolha de dados, nomeadamente o brainstorming e o uso de entrevistas aprofundadas semiestruturadas, realizadas individualmente e em grupo. Construíram-se dois instrumentos de raiz (o TAPP e a GABF) que permitiram complementar os dados recolhidos junto das PCAs. A análise dos dados foi predominantemente qualitativa (Análise Temática). Da análise dos resultados obtidos nestas três fases, resultaram as primeiras versões portuguesas do CDP e do POPS. No que diz respeito às consequências dos AVCs e da afasia na vida diária das PCAs na componente das Funções e Estruturas do Corpo, os três grupos consideraram a categoria das Funções Mentais Especificas como sendo a mais perturbada. Relativamente à componente das Actividades/Participação, as consequências relatadas centram-se nas categorias das Interacções e Relacionamentos Pessoais, Vida Comunitária Social e Cívica e Áreas Principais da Vida. Quanto às Barreiras e Facilitadores, os TFs valorizam as Barreiras de Informação e as Barreiras Estruturais como as que mais interferem com a Participação social das PCAs, enquanto estas e os F/A valorizam os Factores Pessoais, as Barreiras Ambientais e as Barreiras Atitudinais. Os TFs realçam a importância de existirem “redes de suporte familiar” como Facilitadores. As PCAs e os F/A valorizam os Facilitadores Ambientais e os Facilitadores Atitudinais. No que diz respeito aos instrumentos em estudo, a maioria dos TFs assim como o grupo dos F/A considerou a apresentação visual do POPS e mais especificamente as escalas de notação usadas como sendo muito complexas, enquanto as PCAs envolvidas no estudo não fizeram qualquer referência ou crítica às mesmas. A maioria dos TFs considerou os itens do POPS como sendo relevantes para a população portuguesa com afasia. Contudo, metade destes mostrou preocupação com a ambiguidade de alguns dos seus itens e cerca de um terço considerou as instruções difíceis de compreender. As PCAs, assim como os F/A consideraram os itens do POPS, na sua generalidade, como sendo claros, relevantes e não ambíguos. A maioria dos TFs e dos F/A referem falta de clareza de algumas das imagens utilizadas no CDP. Contudo, o grupo das PCAs considera que estas são claras e facilitam a compreensão dos itens. Nenhum dos três grupos consultados fez referência ao tipo e tamanho de letra usada no CDP pelo que se considera ser adequada. A maior parte dos TFs não faz qualquer referência à falta de clareza dos itens do CDP, contudo metade considera alguns dos seus itens ambíguos e um terço questiona também a sua relevância. Os itens do CDP são considerados claros, relevantes e não ambíguos quer pelo grupo das PCAs quer pelo grupo dos F/A. Conclui-se que ambos os instrumentos vão, de uma forma geral, ao encontro das necessidades apresentadas pelas PCAs envolvidas no nosso estudo. Poderá afirmar-se também que estes mostraram ser ferramentas terapêuticas importantes para utilizar em Portugal. Contudo, ambos deixam a descoberto algumas áreas consideradas importantes pelos grupos envolvidos e pela literatura internacional, sugerindo-se a sua utilização simultânea de modo a poderem complementar-se, assim como o recurso a outras formas de avaliação disponíveis, no sentido de colmatar possíveis lacunas encontradas após a sua utilização. Sugere-se o desenvolvimento de investigações futuras que permitam o seu aperfeiçoamento.

O regresso dos emigrantes portugueses e o desenvolvimento do turismo em Portugal

Atendendo ao protagonismo que o Turismo Residencial tem vindo a assumir, no âmbito académico e político, a análise conceptual dos termos Turismo, Turismo Residencial e “Segunda Residência” revelou-se crucial nesta tese para se avaliar o seu impacte no desenvolvimento “rural”. A sua relação com as migrações (internas e internacionais) permitiu identificar o potencial que o regresso e fixação dos emigrantes portugueses apresentam para impulsionar o desenvolvimento do turismo em Portugal. As implicações da ambiguidade conceptual associada com o termo “rural” manifestam-se igualmente na falta de consenso quanto à natureza específica do processo de desenvolvimento “rural” e na dificuldade de identificação de políticas mais adequadas aos problemas prioritários destes territórios. Neste âmbito, o índice de centralidade dos centros urbanos, baseado nas áreas de influência e na marginalidade funcional, permite identificar as áreas com menor capacidade de polarização, que são as áreas mais carenciadas. Reconhecendo que muitas delas albergam atrativos capazes de motivar a deslocação de pessoas, por motivos de recreio ou de lazer, o desenvolvimento sustentável do setor do turismo, sob certas condições, apresenta-se capaz de constituir-se como um motor da atividade económica em geral, ajudando à redução das assimetrias de desenvolvimento existentes, e uma oportunidade para melhorar a qualidade de vida das suas populações. Os resultados da aplicação de 5157 questionários aos emigrantes portugueses suportam esta argumentação, uma vez que são sobretudo os que possuem residência própria num concelho com menor índice de centralidade que mais podem contribuir para o desenvolvimento do turismo em Portugal.

Phenotypic consequences of genome mistranslation in Candida albicans

Várias espécies do género Candida traduzem o codão CUG de leucine como serina. Em C. albicans este codão é traduzido pelo tRNACAG Ser de serina que é reconhecido por leucil- e seril-tRNA sintetases (LeuRS e SerRS), permitindo a incorporação de leucina ou serina em posições com CUG. Em condições padrão de crescimento os codões CUG é incorporam 3% de leucina e 97% de serina, no entanto estes valores são flexíveis uma vez que a incorporação de serina pode variar entre 0.6% e 5% em resposta a condições de stress. Estudos anteriores realizados in vivo em Escherichia coli sugeriram que a ambiguidade em codões CUG é regulada pela SerRS. De facto, o gene da SerRS de C. albicans tem um codão CUG na posição 197 (Ser197) cuja descodificação ambígua resulta na produção de duas isoformas de SerRS. A isoforma SerRS_Leu197 é mais ativa, apesar de menos estável, que a isoforma SerRS_Ser197, suportando a ideia da existência de um feedback loop negativo, envolvendo estas duas isoformas de SerRS, a enzima LeuRS e o tRNACAG Ser, que mantem os níveis de incorporação de leucina no codões CUG baixos. Nesta tese demonstramos que tal mecanismo não é operacional nas células de C. albicans. De facto, os níveis de incorporação de leucina em codões CUG flutuam drasticamente em resposta a alterações ambientais. Por exemplo, a incorporação de leucina pode chegar a níveis de 49.33% na presença de macrófagos e anfotericina B, mostrando a notória tolerância de C. albicans à ambiguidade. Para compreender a relevância biológica da ambiguidade do código genético em C. albicans construímos estirpes que incorporam serina em vários codões. Apesar da taxa crescimento ter sido negativamente afetada em condições padrão de crescimento, as estirpes construídas crescem favoravelmente em várias condições de stresse, sugerindo que a ambiguidade desempenha um papel importante na adaptação a novos nichos ecológicos. O transcriptoma das estirpes construídas de C. albicans e Saccharomyces. cerevisiae mostram que as leveduras respondem à ambiguidade dos codões de modo distinto. A ambiguidade induziu uma desregulação moderada da expressão génica de C. albicans, mas ativou uma resposta comum ao stresse em S. cerevisiae. O único processo celular que foi induzido na maioria das estirpes foi a oxidação redução. De salientar, que enriquecimento em elementos cis de fatores de transcrição que regulam a resposta à ambiguidade em ambas as leveduras foi distinta, sugerindo que ambas respondem ao stresse de modo diferente. Na globalidade, o nosso estudo aprofunda o conhecimento da elevada tolerância à ambiguidade de codões em C. albicans. Os resultados sugerem que este fungo usa a ambiguidade do codão CUG durante infeção, possivelmente para modular a sua interação com o hospedeiro e a resposta a drogas antifúngicas.

Molecular genomics of a genetic code alteration

The genetic code is not universal. Alterations to its standard form have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes and demolished the dogma of an immutable code. For instance, several Candida species translate the standard leucine CUG codon as serine. In the case of the human pathogen Candida albicans, a serine tRNA (tRNACAGSer) incorporates in vivo 97% of serine and 3% of leucine in proteins at CUG sites. Such ambiguity is flexible and the level of leucine incorporation increases significantly in response to environmental stress. To elucidate the function of such ambiguity and clarify whether the identity of the CUG codon could be reverted from serine back to leucine, we have developed a forced evolution strategy to increase leucine incorporation at CUGs and a fluorescent reporter system to monitor such incorporation in vivo. Leucine misincorporation increased from 3% up to nearly 100%, reverting CUG identity from serine back to leucine. Growth assays showed that increasing leucine incorporation produced impressive arrays of phenotypes of high adaptive potential. In particular, strains with high levels of leucine misincorporation exhibited novel phenotypes and high level of tolerance to antifungals. Whole genome re-sequencing revealed that increasing levels of leucine incorporation were associated with accumulation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and loss of heterozygozity (LOH) in the higher misincorporating strains. SNPs accumulated preferentially in genes involved in cell adhesion, filamentous growth and biofilm formation, indicating that C. albicans uses its natural CUG ambiguity to increase genetic diversity in pathogenesis and drug resistance related processes. The overall data provided evidence for unantecipated flexibility of the C. albicans genetic code and highlighted new roles of codon ambiguity on the evolution of genetic and phenotypic diversity.

Scalable semantic aware context storage

In recent years the Internet has grown by incorporating billions of small devices, collecting real-world information and distributing it though various systems. As the number of such devices grows, it becomes increasingly difficult to manage all these new information sources. Several context representation schemes have tried to standardize this information, however none of them have been widely adopted. Instead of proposing yet another context representation scheme, we discuss an efficient way to deal with this diversity of representation schemes. We define the basic requirements for context storage systems, analyse context organizations models and propose a new context storage solution. Our solution implements an organizational model that improves scalability, semantic extraction and minimizes semantic ambiguity.

Codon ambiguities as a mechanism to alter the genetic code in Saccharomyces cerevisiae

Although the genetic code is generally viewed as immutable, alterations to its standard form occur in the three domains of life. A remarkable alteration to the standard genetic code occurs in many fungi of the Saccharomycotina CTG clade where the Leucine CUG codon has been reassigned to Serine by a novel transfer RNA (Ser-tRNACAG). The host laboratory made a major breakthrough by reversing this atypical genetic code alteration in the human pathogen Candida albicans using a combination of tRNA engineering, gene recombination and forced evolution. These results raised the hypothesis that synthetic codon ambiguities combined with experimental evolution may release codons from their frozen state. In this thesis we tested this hypothesis using S. cerevisiae as a model system. We generated ambiguity at specific codons in a two-step approach, involving deletion of tRNA genes followed by expression of non-cognate tRNAs that are able to compensate the deleted tRNA. Driven by the notion that rare codons are more susceptible to reassignment than those that are frequently used, we used two deletion strains where there is no cognate tRNA to decode the rare CUC-Leu codon and AGG-Arg codon. We exploited the vulnerability of the latter by engineering mutant tRNAs that misincorporate Ser at these sites. These recombinant strains were evolved over time using experimental evolution. Although there was a strong negative impact on the growth rate of strains expressing mutant tRNAs at high level, such expression at low level had little effect on cell fitness. We found that not only codon ambiguity, but also destabilization of the endogenous tRNA pool has a strong negative impact in growth rate. After evolution, strains expressing the mutant tRNA at high level recovered significantly in several growth parameters, showing that these strains adapt and exhibit higher tolerance to codon ambiguity. A fluorescent reporter system allowing the monitoring of Ser misincorporation showed that serine was indeed incorporated and possibly codon reassignment was achieved. Beside the overall negative consequences of codon ambiguity, we demonstrated that codons that tolerate the loss of their cognate tRNA can also tolerate high Ser misincorporation. This raises the hypothesis that these codons can be reassigned to standard and eventually to new amino acids for the production of proteins with novel properties, contributing to the field of synthetic biology and biotechnology.