Chemical characterization and evaluation of biological activity of Cynara cardunculus extractable compounds

The Mediterranean species Cynara cardunculus L. is recognized in the traditional medicine, for their hepatoprotective and choleretic effects. Biomass of C. cardunculus L. var. altilis (DC), or cultivated cardoon, may be explored not only for the production of energy and pulp fibers, but also for the extraction of bioactive compounds. The chemical characterization of extractable components, namely terpenic and phenolic compounds, may valorize the cultivated cardoon plantation, due to their antioxidant, antitumoral and antimicrobial activities. In this study, the chemical composition of lipophilic and phenolic fractions of C. cardunculus L. var. altilis (DC), cultivated in the south of Portugal (Baixo Alentejo region) was characterized in detail, intending the integral valorization of its biomass. The biological activity of cultivated cardoon extracts was evaluated in terms of antioxidant, human tumor cell antiproliferative and antibacterial effects. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was used for the chemical analysis of lipophilic compounds. Sixty-five lipophilic compounds were identified, from which 1 sesquiterpene lactone and 4 pentacyclic triterpenes were described, for the first time, as cultivated cardoon components, such as: deacylcynaropicrin, acetates of β- and α-amyrin, lupenyl acetate and ψ-taraxasteryl acetate. Sesquiterpene lactones were the major family of lipophilic components of leaves (≈94.5 g/kg), mostly represented by cynaropicrin (≈87.4 g/kg). Pentacyclic triterpenes were also detected, in considerably high contents, in the remaining parts of cultivated cardoon, especially in the florets (≈27.5 g/kg). Taraxasteryl acetate was the main pentacyclic triterpene (≈8.9 g/kg in florets). High pressure liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) was utilized for the chemical analysis of phenolic compounds. Among the identified 28 phenolic compounds, eriodictyol hexoside was reported for the first time as C. cardunculus L. component, and 6 as cultivated cardoon components, namely 1,4-di-O-caffeoylquinic acid, naringenin 7-O-glucoside, naringenin rutinoside, naringenin, luteolin acetylhexoside and apigenin acetylhexoside. The highest content of the identified phenolic compounds was observed in the florets (≈12.6 g/kg). Stalks outer part contained the highest hydroxycinnamic acids abundance (≈10.3 g/kg), and florets presented the highest flavonoids content (≈10.3 g/kg). The antioxidant activity of phenolic fraction was examined through 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay. Stalks outer part, and receptacles and bracts extracts demonstrated the highest antioxidant effect on DPPH (IC50 of 34.35 μg/mL and 35.25 μg/mL, respectively). (cont.) abstract (cont.) The DPPH scavenging effect was linearly correlated with the total contents of hydroxycinnamic acids (r = -0.990). The in vitro antiproliferative activity of cultivated cardoon lipophilic and phenolic extracts was evaluated on a human tumor cells line of triple-negative breast cancer (MDA-MB-231), one of the most refractory human cancers to conventional therapeutics. After 48 h of exposition, leaves lipophilic extract showed higher inhibitory effect (IC50 = 10.39 μg/mL) than florets lipophilic extract (IC50 = 315.22 μg/mL), upon MDA-MB-231 cellular viability. Pure compound of cynaropicrin, representative of the main compound identified in leaves lipophilic extract, also prevented the cell proliferation of MDA-MB-231 (IC50 = 17.86 μM). MDA-MB-231 cells were much more resistant to the 48 h- treatment with phenolic extracts of stalks outer part (IC50 = 3341.20 μg/mL) and florets (IC50 > 4500 μg/mL), and also with the pure compound of 1,5-di-O-caffeoylquinic acid (IC50 = 1741.69 μM). MDA-MB-231 cells were exposed, for 48 h, to the respective IC50 concentrations of leaves lipophilic extract and pure compound of cynaropicrin, in order to understand their ability in modelling cellular responses, and consequently important potentially signaling pathways for the cellular viability decrease. Leaves lipophilic extract increased the caspase-3 enzymatic activity, contrarily to pure compound of cynaropicrin. Additionally, leaves lipophilic extract and pure compound of cynaropicrin caused G2 cell cycle arrest, possibly by upregulating the p21Waf1/Cip1 and the accumulation of phospho-Tyr15-CDK1 and cyclin B1. The inhibitory effects of leaves lipophilic extract and cynaropicrin pure compound, against the MDA-MB-231 cell proliferation, may also be related to the downregulation of phospho-Ser473-Akt. The antibacterial activity of cultivated cardoon lipophilic and phenolic extracts was assessed, for the first time, on two multidrug-resistant bacteria, such as the Gram-negative Pseudomonas aeruginosa PAO1 and the Gram-positive methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), two of the main bacteria responsible for health care-associated infections. Accordingly, the minimum inhibitory concentrations (MIC) were determined. Lipophilic and phenolic extracts of florets did not have antibacterial activity on P. aeruginosa PAO1 and MRSA (MIC > 2048 μg/mL). Leaves lipophilic extract did not prevent the P. aeruginosa PAO1 growth, but pure compound of cynaropicrin was slightly active (MIC = 2048 μg/mL). Leaves lipophilic extract and pure compound of cynaropicrin blocked MRSA growth (MIC of 1024 and 256 μg/mL, respectively). The scientific knowledge revealed in this thesis, either by the chemical viewpoint, or by the biological viewpoint, contributes for the valorization of C. cardunculus L. var. altilis (DC) biomass. Cultivated cardoon has potential to be exploited as source of bioactive compounds, in conciliation with other valorization pathways, and Portuguese traditional cheeses manufacturing.

Serviços dos ecossistemas prestados pelos estuários : especiação e capacidade de retenção do fósforo

O fator nutricional presente nos sapais não é só importante para os organismos que nele habitam como também apresenta uma importância ecológica a uma maior escala. Exemplifica-se este fato com a capacidade de retenção do Fósforo (P) por parte das plantas podendo estas competir como produto químicos para sua imobilização através da incorporação da sua fração biodisponível para cumprimento dos mecanismos básicos de sobrevivência. O rizosedimento dessas plantas é uma importante fonte de nutrientes necessários para garantia básica da perpetuação de todos os serviços (regulação, provisão, cultural) gerados pelo ambiente. A perda de áreas de sapal foi o motivo principal para a elaboração desta tese visto a preocupação em relação aos impactes que a perda de serviços associados à área de estudo escolhida, o sistema lagunar da Ria de Aveiro, poderá vir sofrer caso aconteçam alterações hídricas (naturais ou antrópicas) mais acentuadas no futuro. Essa tese assume como compromisso chamar a atenção para essa questão como também investigar os mecanismos do ciclo do P este importante nutriente considerado essencial para a manutenção da vida em nosso planeta. Para este estudo foram escolhidas 3 espécies de plantas halófitas representantes do sapal amostral, são elas: Bolbochenous maritimus, Spartina maritima e de Juncus maritimus. As questões levantadas buscam compreender o papel do P nas transformações que ocorrem no rizosedimento das halófitas em 3 diferentes contextos: (i) quando comparados os valores da biomassa de P associado às halófitas estudadas (estudo realizado nos sapais povoados por Spartina maritima e Juncus maritimus) em toda extensão da Ria de Aveiro (ii) quando da disponibilidade de P perante a presença de poluentes inorgânicos no Largo do Laranjo, que corresponde a uma zona historicamente contaminada por metais (estudo realizado no rizosedimento das espécies Bolbochenous maritimus e Juncus maritimus) e (iii) quanto à intrusão superficial da água salgada da laguna (estudo focado na avaliação da perda do P próximo às raízes das halófitas que habitam a zona externa do dique do Baixo Vouga Lagunar (BVL) que corresponde à zona de confluência do Rio Vouga com a Ria de Aveiro). Por meio da análise do rizosedimento e da biomassa das diferentes halófitas predominantes do sapal foi possível verificar que, em relação à carga nutritiva fosfática, de Norte (Canal de São Jacinto/Ovar) a Sul (Canal de Mira) da Ria de Aveiro, a cota do sapal é mais importante do que a natureza espacial do sistema. Esta informação é primordial para a assertividade de futuras medidas de criação e reabilitação das áreas de sapal na Ria de Aveiro. Os estudos realizados nas áreas impactadas (Largo do Laranjo e BVL) incidiram na análise do perfil vertical rizosedimentar das halófitas pertencentes ao sapal médio-alto. Estes estudos revelaram que o rizosedimento dessas halófitas possui características peculiares que definem a dinâmica do ciclo do P de forma bastante característica. O rizosedimento das halófitas presentes no Largo do Laranjo apresentaram teores biodisponíveis de P equivalentes àqueles presentes no rizosedimento de área mais afastada da fonte pontual de contaminação para as mesmas espécies. Numa visão otimista, os resultados revelam que ambos sapais, Largo de Laranjo e Cais do Bico, apresentam condições equiparável para perpetuação dos serviços por eles gerados, que nesse caso se tornam ainda mais valiosos devido a garantia da fitoestabilização dos contaminantes (prevenção da entrada de contaminantes na coluna d’água e na cadeia alimentar). No Baixo Vouga Lagunar a análise espacial do sapal na zona exterior ao dique revelou a perda da diversidade das espécies bem como o aumento da área de vasa e consequentemente a perda dos teores de P associados ao rizosedimento das halófitas mais expostas aos efeitos da compressão costeira intensificados pelas ações naturais e antrópicas a que a Ria está sujeita. Em geral, a degradação dessa área de sapal devido aos fenômenos de assoreamento ou de erosão não pode ser separada dos processos sedimentares na área envolvente, principalmente no caso da Ria de Aveiro que tem sofrido constantes mudanças para atender às necessidades das atividades humanas. Essa tendência provavelmente não mudará no futuro próximo. Consequentemente, a evolução da laguna será principalmente dependente do resultado direto das ações humanas que deverão sempre encontrar formas de compensar os danos causados no âmbito de intervenções de reabilitação do sistema hídrico. A recriação de áreas de sapal pode ter lugar como medida mitigadora no âmbito de intervenções de reabilitação de áreas degradadas e ainda poderá servir como forma de captura de P para programas de utilização de fertilizantes naturais (componente desejável para a agricultura moderna o que é particularmente importante para as regiões altamente dependentes do mercado de importação). Deste modo, recomenda-se que a recuperação das áreas de sapal seja enquadrada no âmbito de intervenções mais amplas de valorização dos sistemas estuarinos e lagunares.