37 resultados para BIOLOGIA CELULAR
Resumo:
Dada a extrema importncia econmica e ambiental que o montado de sobro tem em Portugal, e dado o declnio deste devido a vrias razes (e.g. doena, idade das plantas) premente desenvolver estratgias de preservao de sobreiros elite e optimizar tcnicas para a propagao destes gentipos. No primeiro Captulo expe-se uma breve introduo sobre o montado actual e as tcnicas actuais de regenerao/propagao do sobreiro. Descreve-se ainda as principais tcnicas de preservao e avaliao de estabilidade gentica referidas na literatura para sobreiro e outras lenhosas. No Captulo II apresentado um estudo de melhoramento das condies actuais de maturao de embries somticos de sobreiro com vista a aperfeioar o processo de converso em plantas. Neste captulo apresentado um protocolo melhorado em relao ao actual que permite um desenvolvimento dos embries somticos dum modo semelhante aos embries zigticos em termos de substncias de reserva. O Captulo III mostra um estudo efectuado com o objectivo principal de avaliar estabilidade gentica durante todo o processo de embriognese somtica. Neste captulo so apresentados resultados duma anlise feita por RAPD em fases distintas da embriognese somtica de sobreiro. Neste estudo mostra-se que no existem diferenas significativas entre plantas de campo, embries somticos e plantas regeneradas. No Captulo VI, pretende-se complementar o estudo anterior. Neste Captulo descreve-se a dinmica do ciclo celular durante as primeiras fases de embriognese somtica na presena de reguladores de crescimento. Este trabalho permitiu concluir a importncia dos reguladores de crescimento na induo e perceber o peso do factor gentipo durante o processo. Considerando os resultados anteriores, a necessidade de um processo eficiente de preservao de gentipos elite torna-se fundamental. No Captulo V descreve-se um protocolo de criopreservao eficiente sem recursos a substncias txicas. Nesta seco ainda feita uma anlise de variabilidade gentica aps criopreservao atravs de FCM, AFLP e SSR. Todos os resultados obtidos anteriormente so postos a prova no Captulo VI onde se faz uma monitorizao extensiva de 10 gentipos elite, tendo em conta a sua capacidade de produo de cortia, atravs do processo de embriognese somtica. Durante esta seco so utilizados os protocolos desenvolvidos anteriormente e avaliados na sua eficincia. Neste captulo descrita a integrao de vrios segmentos deste estudo num s protocolo eficiente de regenerao e preservao de sobreiros atravs de embriognese somtica. Finalmente, no Captulo VI so apresentadas as concluses da presente Tese de Doutoramento, com especial incidncia para linhas de investigao futuras a serem tomadas. Discute-se a importncia deste novo protocolo na optimizao da produo da cortia e traam-se possveis aplicaes alternativas.
Resumo:
Os contaminantes provenientes quer de fontes naturais quer como consequncia da atividade humana, tm contribudo para a degradao dos ecossistemas aquticos. Entre estes encontram-se os metais que podem, ou no ser essenciais mediante o papel que desempenham no metabolismo dos organismos. O cobre e o zinco so exemplos de metais essenciais, contudo quando atingem concentraes elevadas podem tornar-se txicos. Os detritvoros aquticos desempenham um papel fundamental na decomposio da matria orgnica, alimentando-se de carcaas e partes de plantas que caem nos cursos de gua. Assim, estes organismos permitem que o ciclo dos nutrientes se complete e servem como elo de ligao entre todos os grupos funcionais do ecossistema mantendo o seu equilbrio estrutural e funcional. Sendo a matria orgnica a sua principal fonte de energia esto sujeitos contaminao existente no meio, pelo que de todo o interesse proceder-se avaliao dos efeitos da toxicidade de metais nestes organismos. Uma vez que as diferenas comportamentais consequentes desta exposio podem originar variaes na densidade e diversidade, o que se refletir a nvel das comunidades, originando alteraes na estrutura e funcionamento do ecossistema. Tendo em vista a avaliao dos efeitos da contaminao por metais em detritvoros, o principal objetivo deste trabalho foi comparar a sensibilidade a metais essenciais de dois detritivoros aquticos, o camaro Atyaephyra desmarestii e o anfpode Echinogammarus meridionalis. Para tal, avaliaram-se os efeitos do cobre e do zinco a diferentes nveis de organizao biolgica. Primeiro, foram determinadas as preferncias alimentares de A. desmarestii e E. meridionalis considerando tanto a rea das folhas como a contaminao por metais das folhas. Em seguida, avaliaram-se os efeitos do cobre e do zinco na sobrevivncia e inibio alimentar de ambas as espcies. Finalmente, avaliaram-se os efeitos destes mesmos metais a nvel bioqumico utilizando uma bateria de biomarcadores que incluiu enzimas de stresse oxidativo, o sistema de defesa antioxidante e as colinesterases. Ambos os organismos no mostraram preferncia em relao a folhas de rea diferente. A presena de uma maior ou menor concentrao de metais essenciais no alimento no teve qualquer influncia na sua escolha pelo alimento (contaminado ou no). Os ensaios agudos de cobre e zinco mostraram que o cobre mais txico para ambas as espcies do que o zinco. O camaro demonstrou ser mais sensvel ao zinco que o anfpode, tendo este sido mais sensvel ao cobre ( CL50 do cobre para A. desmarestii foi de 0,128 mg.l-1 e o de E. meridionalis foi de 0,050 mg.l-1; os valores correspondentes para o zinco foram 7,951 e 11,860 mg.l-1, respectivamente. Em relao aos efeitos subletais, o cobre teve efeitos notrios na taxa de alimentao de E. meridionalis, mas no afectou a de A. desmarestii. No que diz respeito exposio ao zinco, ambas as espcies parecem apresentar tendncia para inibir a alimentao. A caracterizao das colinesterases revelou que a principal forma presente em ambas as espcies a acetilcolinesterase, a qual que no foi afetada pela presena dos metais, no caso do camaro, mas parece ser inibida pelo zinco no caso do anfpode. O cobre inibiu o sistema de defesa enzimtico de ambas as espcies, sem sinais de danos lipdicos. Para alm disto, inibiu uma das enzimas antioxidantes (GPx) do anfpode. Apesar de no ter ocorrido dano lipdico aps exposio ao cobre, observou-se um ligeiro aumento dos nveis das LPO, o que pode ser indicativo de uma potencial existncia de dano oxidativo, como resultado da falha do sistema de defesa antioxidante. Por outro lado, o zinco induziu o sistema de defesa em E. meriodionalis prevenindo o dano lipdico. Enquanto em A. desmarestii o sistema enzimtico antioxidante no respondeu, tendo ocorrido dano celular oxidativo considerando-se, assim, que o sistema de defesa antioxidante do camaro pode ser comprometido por exposio a metais. Ainda que os danos celulares oxidativos tivessem ocorrido a baixas concentraes de zinco. A exposio a este metal tambm induziu a actividade da GST de E. meriodionalis. Considerando que a taxa de alimentao foi severamente reduzida no caso deste organismo, o zinco parece ser o metal cuja concentrao no ecossistema requer maior ateno. Integrando as respostas dos biomarcadores parece tambm evidente que A. desmarestii responde de uma maneira geral a maiores concentraes dos dois metais, enquanto a resposta de E. meridionalis ocorre a concentraes inferiores. Pelo que, E. meridionalis parece ser mais sensvel ao nvel bioqumico. Neste trabalho, os dois detritvoros, com ligeiras diferenas no modo como utilizam a matria orgnica disponvel, apresentam diferenas na sensibilidade aos metais essenciais a vrios nveis de organizao biolgica, sendo o zinco o metal que poder causar maior preocupao a nvel bioqumico, enquanto o cobre parece ser o mais txico ao nvel do organismo, causando mortalidade a concentraes mais baixas.
Resumo:
O tributilestanho (TBT) considerado um dos xenobiticos mais txicos, produzidos e deliberadamente introduzidos no meio ambiente pelo Homem. Tem sido usado numa variedade de processos industriais e subsequentemente descarregado no meio ambiente. O tempo de meia-vida do TBT em guas marinhas de vrias semanas, mas em condies de anxia nos sedimentos, pode ser de vrios anos, devido sua degradao mais lenta. Embora o TBT tenha sido descrito como sendo txico para eucariotas e procariotas, muitas bactrias podem ser resistentes a este composto. O presente trabalho teve como objetivo principal elucidar o mecanismo de resistncia ao TBT em bactrias. Para alm disso, pretendeu-se desenvolver um bioreprter para detectar TBT no ambiente. Para atingir estes objetivos foram delineadas vrias tarefas cujos principais resultados obtidos se apresentam a seguir. Vrias bactrias resistentes ao TBT foram isoladas de sedimento e gua do Porto de Pesca Longnqua (PPL) na Ria de Aveiro, Portugal. Entre estas, Aeromonas molluscorum Av27 foi selecionada devido sua elevada resistncia a este composto (concentraes at 3 mM), sua capacidade de degradar o TBT em compostos menos txicos (dibutilestanho, DBT e monobutilestanho, MBT) e tambm por usar o TBT como fonte de carbono. A. molluscorum Av27 foi caracterizada genotipica e fenotipicamente. Os fatores de virulncia estudados mostraram que esta estirpe i) possui atividade lipoltica; ii) no citotxica para clulas de mamferos, nomeadamente para clulas Vero; iii) no possui integres de classe I e II e iv) possui cinco plasmdeos com aproximadamente 4 kb, 7 kb, 10 kb, 100 kb e mais de 100 kb. Estes resultados mostraram que a estirpe Av27 no txica, aumentando assim o interesse nesta bactria para futuras aplicaes, nomeadamente na bioremediao. Os testes de toxicidade ao TBT mostraram que este composto tem um impacto negativo no crescimento desta estirpe, bem como, na densidade, no tamanho e na atividade metablica das clulas e responsvel pela formao de agregados celulares. Assim, o TBT mostrou ser bastante txico para as bactrias interferindo com a atividade celular geral. O gene Av27-sugE, que codifica a protena SugE pertencente famlia das small multidrug resistance proteins (SMR), foi identificado como estando envolvido na resistncia ao TBT nesta estirpe. Este gene mostrou ser sobreexpresso quando as clulas crescem na presena de TBT. O promotor do gene Av27-sugE foi utilizado para construir um bioreporter para detetar TBT, contendo o gene da luciferase do pirilampo como gene reprter. O bioreprter obtido rene as caractersticas mais importantes de um bom bioreprter: sensibilidade (intervalo de limite de deteco de 1-1000 nM), rapidez (3 h so suficientes para a deteo de sinal) e, possivelmente, no invasivo (pois foi construdo numa bactria ambiental). Usando sedimento recolhido no Porto de Pesca Longnqua da Ria de Aveiro, foi preparada uma experincia de microcosmos com o intuito de avaliar a capacidade de Av27 para bioremediar o TBT, isoladamente ou em associao com a comunidade bacteriana indgena. A anlise das amostras de microcosmos por PCR-DGGE e de bibliotecas de 16S rDNA revelaram que a comunidade bacteriana relativamente estvel ao longo do tempo, mesmo quando Av27 inoculada no sedimento. Para alm disso, o sedimento estuarino demonstrou ser dominado por bactrias pertencentes ao filo Proteobacteria (sendo mais abundante as Delta e Gammaproteobacteria) e Bacteroidetes. Ainda, cerca de 13% dos clones bacterianos no revelaram nenhuma semelhana com qualquer dos filos j definidos e quase 100% afiliou com bactrias no cultivveis do sedimento. No momento da concluso desta tese, os resultados da anlise qumica de compostos organoestnicos no estavam disponveis, e por essa razo no foi possvel tirar quaisquer concluses sobre a capacidade desta bactria remediar o TBT em sedimentos. Esses resultados iro ajudar a esclarecer o papel de A. molluscorum Av27 na remediao de TBT. Recentemente, a capacidade da estirpe Av27 remediar solo contaminado com TBT foi confirmada em bioensaios realizados com plantas, Brassica rapa e Triticum aestivum (Silva 2011a), e tambm com invertebrados Porcellionides pruinosus (Silva 2011B). Assim, poder-se- esperar que a bioremediao do sedimento na experincia de microcosmos tambm tenha ocorrido. No entanto, s a anlise qumica dos compostos organostnicos dever ser conclusiva. Devido dificuldade em realizar a anlise analtica de organoestnicos, um mtodo de bioensaio fcil, rpido e barato foi adaptado para avaliar a toxicidade do TBT em laboratrio, antes de se proceder anlise qumica das amostras. O mtodo provou a sua utilidade, embora tenha mostrado pouca sensibilidade quando se usam concentraes de TBT baixas. Em geral, os resultados obtidos contriburam para um melhor entendimento do mecanismo de resistncia ao TBT em bactrias e mostraram o potencial biotecnolgico de A. molluscorum Av27, nomeadamente, no que refere sua possvel aplicao na descontaminao de TBT no ambiente e tambm no desenvolvimento de bioreprteres.
Resumo:
Os riscos dos resduos provenientes da extrao do urnio esto associados ao seu contedo em metais e radionucldeos, o que levanta preocupaes s autoridades governamentais e populao em geral. As populaes humanas e outras espcies animais que vivem em zonas de explorao de urnio podero estar expostas radiao atravs de resduos e poeiras radioactivase tambm atravs de gua e alimentos contaminados. A determinao dos riscos deste tipo de contaminantes feita, principalmente, atravs da anlise qumica de amostras ambientais, dando-se menos importncia determinao de efeitos biolgicos. A determinao de efeitos biolgicos causados pela exposio a poluentes, tem-se revelado muito importante para uma avaliao da qualidade ambiental, de modo a providenciar indicaes acerca dos efeitos negativos nos seres vivos e tambm para complementar a informao dada pelas anlises qumicas de amostras ambientais. Este facto levou ao estabelecimento de biomarcadores, que consistem em respostas biolgicas adversas que so especficas de uma exposio a toxinas ambientais, para serem usadas como ferramentas de avaliao da qualidade ambiental. Neste trabalho foram analisadas respostas a nvel molecular e celular, em minhocas, ratinhos do campo e humanos, a fim de determinar o risco qumico e radiolgico dos resduos provenientes da mina de urnio da Cunha Baixa. Este trabalho teve tambm como objectivo a clarificao das respostas subjacentes exposio a metais e radionucldeos, a fim de permitir o desenvolvimento de potenciais novos biomarcadores moleculares. Durante este trabalho foram efectuados ensaios com minhocas, em que estas foram expostas durante 56 dias a solo contaminado proveniente da mina de urnio da Cunha Baixa, em laboratrio e in situ. Durante a exposio foram analisados vrios parmetros, como o crescimento, reproduo, bioacumulao de metais e radionucldeos, histopatologia, danos no DNA, citotoxicidade e perfil de expresso gentica. Para alm disso, foram amostrados ratinhos do campo na mina de urnio da Cunha Baixa e numa rea de referncia para determinao de danos no DNA, nveis de expresso e mutaes em genes supressores de tumores e tambm bioacumulao de metais. Por fim, foram recolhidas amostras de sangue em voluntrios saudveis pertencentes populao da aldeia da Cunha Baixa, para determinao de danos no DNA, imunofenotipagem e quantificao de metais no sangue. Os resultados revelaram que as minhocas assim como os ratinhos do campo foram negativamente afetados pela exposio aos resduos mineiros em todos os nveis de organizao biolgica aqui analisados, o que faz destes organismos bons indicadores para a determinao do risco destas reas contaminadas, evidenciando o potencial risco da exposio a estes contaminantes. Para alm disso, o estudo feito populao da Cunha Baixa revelou danos no ADN e diminuio de populaes importantes de clulas imunitrias (nomeadamente linfcitos T e NK), o que poder resultar da exposio aos resduos da mina, tornando as pessoas mais susceptveis ao desenvolvimento de processos de carcinognese. O presente estudo contribuiu significativamente para a caracterizao dos riscos da exposio a resduos provenientes de minas de urnio abandonadas, evidenciando os seus efeitos negativos a nvel molecular e celular, que potencialmente podero causar instabilidade genmica e aumentar o risco de desenvolvimento de doenas genticas.
Resumo:
O desenvolvimento de uma sociedade depende do nvel intelectual e educacional revelado pelos seus cidados, o que determinado tambm pela qualidade de ensino. A consecuo de tal qualidade implica uma adequada formao de professores e esta requer uma reflexo que permita atualizao e inovao constantes do processo de Superviso Pedaggica. Esta deve garantir a mudana e a inovao necessrias das Prticas Pedaggicas (PP), fator relevante na preparao pessoal e profissional dos docentes. No h ensino de qualidade sem uma adequada formao de professores e esta assegurada, obviamente, pela implementao adequada, reflexiva e permanentemente inovada das Prticas Pedaggicas. As instituies formadoras arcam com a grande responsabilidade de procurar mecanismos para dotarem os seus quadros, ou seja, os Supervisores Pedaggicos, de competncias que lhes permitam exercer essa misso de forma cientificamente sustentada. Esta investigao tem por objetivo apresentar um plano de estratgias metodolgicas inovadoras de Superviso com a finalidade de introduzir melhorias no Sistema de Superviso Pedaggica, consubstanciado fundamentalmente, nas Prticas Pedaggicas, no Curso de Biologia do ISCED/HULA - Instituto Superior de Cincias da Educao. O estudo foi desenvolvido no mbito do Curso de Doutoramento de Didtica e Formao da Universidade de Aveiro (Portugal) e enquadradas pelo paradigma ecltico. Decorreu em duas Fase, I e II. A Fase I - estudo preliminar - teve a participao de dois Professores Supervisores (PS) e 59 Alunos Futuros Professores (AFP) do 3 e 4 anos do Curso do Ensino de Biologia. Nesta fase, para a recolha de dados foram realizados inquritos (entrevistas aos PS e questionrios aos AFP). Para o tratamento de dados, recorreu-se anlise de contedo para as entrevistas dos PS e para as questes abertas dos questionrios aos AFP; para as questes fechadas utilizou-se Microsoft Excel. Esta fase de diagnstico teve como objetivo recolher a perceo dos participantes sobre a pertinncia das estratgias metodolgicas em uso na PP no Curso de Biologia e obter as suas sugestes para a respetiva melhoria. Os resultados apontaram fundamentalmente para uma mudana das estratgias das PP e para a incluso de trabalhos prticos (laboratorial e de campo). A Fase II - estudo principal - teve como base os resultados obtidos na fase anterior. Foram concebidas, implementadas e avaliadas aes formativas e investigativas no campo da Superviso Pedaggica, quer aos PS, quer aos AFP, visando responder s necessidades colocadas bem como as sugestes recebidas dos participantes. A recolha de dados foi realizada no mbito das aes formativas/investigativas realizadas com os participantes. A recolha de dados foi realizada atravs de fichas administradas no final de cada sesso, de um questionrio intermdio, para a obteno de opinies acerca das atividades j realizadas para serem introduzidas as emendas julgadas pertinentes com vista a melhoria do processo e de um questionrio final. Como fonte complementar foram usados os porteflios dos AFP, as auscultaes dos participantes, durante e no final do processo, anotados no teaching porteflio do investigador. Foi efetuada uma exposio com todo o material desenvolvido no mbito de uma sesso de reflexo sobre as PP. Ficou consensualmente institucionalizado a realizao anual de um evento para apresentao e discusso dos trabalhos das PP e, sobretudo, para a meta-reflexo das atividades supervisivas desenvolvidas ao longo do ano. As concluses resultantes de todo o estudo, refletem a satisfao de todos os participantes, bem como o reconhecimento de que foi dada uma contribuio para a resposta ao problema levantado, s questes e subquestes da investigao, obtendo-se assim a consecuo dos objetivos preconizados. Como sugesto para futuras investigaes, aponta-se a conceo de aes que visem a mudana das PP para um Estgio Pedaggico. Como implicaes, deste estudo, julga-se poder ter contribudo na melhoria das competncias dos PS, o que poder favorecer as suas estratgias da Superviso Pedaggica. Tudo isto aponta para uma melhor formao do futuro professor, garantindo um ensino de qualidade que proporcionar uma melhor formao de cidados.
Resumo:
Vrias espcies do gnero Candida traduzem o codo CUG de leucine como serina. Em C. albicans este codo traduzido pelo tRNACAG Ser de serina que reconhecido por leucil- e seril-tRNA sintetases (LeuRS e SerRS), permitindo a incorporao de leucina ou serina em posies com CUG. Em condies padro de crescimento os codes CUG incorporam 3% de leucina e 97% de serina, no entanto estes valores so flexveis uma vez que a incorporao de serina pode variar entre 0.6% e 5% em resposta a condies de stress. Estudos anteriores realizados in vivo em Escherichia coli sugeriram que a ambiguidade em codes CUG regulada pela SerRS. De facto, o gene da SerRS de C. albicans tem um codo CUG na posio 197 (Ser197) cuja descodificao ambgua resulta na produo de duas isoformas de SerRS. A isoforma SerRS_Leu197 mais ativa, apesar de menos estvel, que a isoforma SerRS_Ser197, suportando a ideia da existncia de um feedback loop negativo, envolvendo estas duas isoformas de SerRS, a enzima LeuRS e o tRNACAG Ser, que mantem os nveis de incorporao de leucina no codes CUG baixos. Nesta tese demonstramos que tal mecanismo no operacional nas clulas de C. albicans. De facto, os nveis de incorporao de leucina em codes CUG flutuam drasticamente em resposta a alteraes ambientais. Por exemplo, a incorporao de leucina pode chegar a nveis de 49.33% na presena de macrfagos e anfotericina B, mostrando a notria tolerncia de C. albicans ambiguidade. Para compreender a relevncia biolgica da ambiguidade do cdigo gentico em C. albicans construmos estirpes que incorporam serina em vrios codes. Apesar da taxa crescimento ter sido negativamente afetada em condies padro de crescimento, as estirpes construdas crescem favoravelmente em vrias condies de stresse, sugerindo que a ambiguidade desempenha um papel importante na adaptao a novos nichos ecolgicos. O transcriptoma das estirpes construdas de C. albicans e Saccharomyces. cerevisiae mostram que as leveduras respondem ambiguidade dos codes de modo distinto. A ambiguidade induziu uma desregulao moderada da expresso gnica de C. albicans, mas ativou uma resposta comum ao stresse em S. cerevisiae. O nico processo celular que foi induzido na maioria das estirpes foi a oxidao reduo. De salientar, que enriquecimento em elementos cis de fatores de transcrio que regulam a resposta ambiguidade em ambas as leveduras foi distinta, sugerindo que ambas respondem ao stresse de modo diferente. Na globalidade, o nosso estudo aprofunda o conhecimento da elevada tolerncia ambiguidade de codes em C. albicans. Os resultados sugerem que este fungo usa a ambiguidade do codo CUG durante infeo, possivelmente para modular a sua interao com o hospedeiro e a resposta a drogas antifngicas.
Resumo:
Permanece por esclarecer como a via de sinalizao do cAMP modula a exocitose regulada. Os principais objetivos deste trabalho foram: i) avaliar o efeito do cAMP nos eventos exocitticos, nas propriedades dos poros de fuso e na secreo hormonal; ii) perceber o impacto da sinalizao por cAMP-HCN na exocitose e nas propriedades do poro de fuso; e iii) estudar as propriedades do poro de fuso na presena de um agente neurotxico comum, como o alumnio. Lactotrofos, isolados a partir da hipfise anterior de ratos Wistar machos, foram usados como modelo celular. Os eventos unitrios de fuso exocittica e a prolactina (PRL) libertada foram avaliados, respetivamente, em ensaios eletrofisiolgicos efectuados segundo a tcnica de contacto hermtico no modo sobre a clula aderida pipeta porta-eltrodo e com recurso a mtodos imunolgicos de deteo. Os nveis intracelulares de cAMP foram aumentados por 3-isobutil-1-metilxantina (IMBX), forscolina e N6,2'-O-dibutiril adenosina- 3',5'-monofosfato cclico (dbcAMP). A expresso dos canais HCN foi determinada por Western-blot, qRT-PCR e imunocitoqumica em combinao com microscopia confocal. Culturas primrias de lactotrofos foram tambm transfetadas com DNA plasmdico que codifica HCN2 juntamente com a protena-verde-fluorescente e um agente farmacolgico foi usado para avaliar o efeito de cAMP-HCN na exocitose. Observou-se que os lactotrofos responderam forscolina e ao dbcAMP libertando PRL de um modo bifsico e dependente da concentrao, uma vez que a secreo aumentou e diminuiu, respectivamente, na gama de baixas e altas concentraes. Os compostos que elevaram os nveis de cAMP aumentaram os eventos transientes e impediram a fuso completa. Alm disso, o dbcAMP promoveu o aparecimento de eventos exocitticos transientes de elevada periodicidade, cujos poros de fuso, de maior dimetro, se mativeram abertos durante mais tempo. A expresso das quatro isoformas de HCN foi confirmada nos lactotrofos ao nvel do mRNA e, tal como no corao, rim e hipfise, o mais abundante codifica a isoforma HCN2. Nos lactotrofos com sobre-expresso desta isoforma, o dbcAMP no s aumentou a frequncia dos eventos transientes e a condutncia dos poros, mas tambm a frequncia dos eventos de fuso completa. Enquanto o bloqueador dos canais HCN, ZD7288, reduziu a frequncia dos eventos transientes e de fuso completa desencadeados por dbcAMP e diminuiu o dimetro dos poros de fuso. A simultnea diminuio da libertao de PRL, da frequncia dos eventos transientes e do dimetro dos poros de fuso representaram as principais alteraes observados aps pr-tratamento dos lactotrofos com concentrao micromolar de alumnio. Em concluso, os resultados demonstram que elevados nveis de cAMP reduzem a secreo de PRL devido estabilizao dos poros de fuso no estado de maior abertura. Alm disso, a via de sinalizao cAMP-HCN afecta a actividade exocittica e modifica as propriedades dos poros de fuso, que parecem ser igualmente importantes na citotoxicidade induzida por alumnio.
Resumo:
As bactrias desempenham um papel chave na reciclagem de energia e matria nas teias trficas aquticas. No entanto, as suas pequenas dimenses, curto tempo de gerao e o facto de os seus genomas constiturem uma grande poro do seu volume celular, tornam as bactrias mais suscetveis s alteraes ambientais que os organismos superiores. O aumento dos nveis de radiao UVB (280-320 nm) constitui uma ameaa particularmente importante para as comunidades bacterianas dos sistemas aquticos, uma vez que a radiao consegue penetrar at profundidades considerveis. No entanto, os mecanismos atravs dos quais a radiao causa danos nas bactrias ainda no so claros, o que impede a modelao precisa dos efeitos da radiao UV nas comunidades bacterianas naturais. O bacterioneuston habita a microcamada superficial (primeiro milmetro da coluna de gua), estando naturalmente exposto a nveis de radiao UV superiores aos que o bacterioplncton est exposto. Deste modo, a microcamada superficial pode ser vista como um nicho ecolgico modelo para estudar as interaes entre as bactrias e a radiao UV. Os objetivos deste trabalho foram (i) avaliar a influncia do nvel de exposio natural radiao das comunidades bacterianas na sua sensibilidade radiao UV, atravs da comparao das respostas fotobiolgicas do bacterioneuston e bacterioplncton; (ii) aprofundar o conhecimento acerca dos mecanismos atravs dos quais a radiao UV causa danos, bem como dos fatores que afetam a interao entre a radiao UV e as bactrias; e (iii) avaliar o potencial da protena RecA, que medeia a resposta SOS das bactrias, para ser usada como marcador de danos induzidos por UV nas comunidades bacterianas. Verificou-se que o bacterioneuston mais resistente radiao UVB que o bacterioplncton e recupera de modo mais eficiente dos danos induzidos por UV, particularmente em condies de escassez de nutrientes, indicando assim que o nvel de exposio natural das comunidades bacterianas radiao afeta a sua sensibilidade radiao UV. Os resultados das anlises independentes do cultivo revelaram o potencial da radiao UV para afetar a estrutura das comunidades bacterianas ao selecionar bactrias resistentes. A anlise do perfil de utilizao de fontes de carbono usando o sistema de Ecoplacas Biolog e a determinao das taxas de incorporao de leucina e timidina permitiu tambm verificar que a radiao UV modifica o funcionamento das comunidades bacterianas. Os resultados obtidos indicam a possibilidade do bacterioneuston conter um conjunto de estirpes resistentes a UV que, mediante as condies meteorolgicas apropriadas, podem ser selecionadas aquando da exposio radiao.
Resumo:
Relevncia etnofarmacolgica: Artemisia gorgonum (Asteraceae), conhecida como losna ou lorna, usada em Cabo Verde na medicina tradicional para o tratamento de inflamaes, febre e gastroenterites. Estudos recentes sugerem que artimetina, isolada a partir de Artemisa gorgonum, poderia ser usada para o tratamento da malria devido sua atividade antiplasmodial. Objetivo do estudo: Avaliao in vitro da atividade anti-microbiana e sinergtica dos extratos hidroetanol (70%) e metanol de A. gorgonum (EHAG e EMAG) em bactrias do trato urinrio e uma espcie de fungo. A atividade antioxidante dos extratos de hidroetanol (70%), metanol, clorofrmio e clorofrmio-metanol (1:2), e o efeito protetor de EHAG contra leses hepticas em ratos induzidos com CCl4 tambm foram analisados. Material e mtodos: A atividade antimicrobiana dos extratos de A. gorgonum foi testada in vitro contra sete estirpes de microrganismos, incluindo bactrias Gram-positivas, Gram-negativas e uma espcie de fungo. O mtodo DAA (Decimal assay for additivity) foi determinado para atividade antibacteriana do EHAG contra Pseudomonas aeruginosa. O efeito antioxidante in vitro de vrios extratos de A. gorgonum foi analisado pelo mtodo DPPH. A leso heptica foi induzida por injeo intrapeitoral do CCl4. Seguidamente, os ratos foram administrados oralmente com EHAG, diariamente, por um perodo de 7 dias. Resultados e Discusso: Foi observada atividade antibacteriana dos extratos de EHAG e EMAG contra todos os microrganismos usados neste estudo. O crescimento das estirpes de Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa foi o mais inibido por ambos os extratos, apresentando valores significativos, enquanto o crescimento das estirpes S. aureus e Klebsiella spp. foi o menos afetado. Candida albicans foi inibida fortemente pelo EMAG. As combinaes de extrato hidroetanlico com antibiticos demonstraram atividade antibacteriana sinergtica contra todos os patognicos testados. Em contrapartida, a combinao de extrato metanlico com antibiticos permitiu observar efeitos antagnicos contra todas as bactrias, exceto Klebsiella spp. que apresentou atividade sinrgica. O EHAG e EMAG mostraram efeito significativo na eliminao do radical DPPH. A atividade hepatoprotetora foi observada em ratos previamente administrados com CCl4. Estes estudos evidenciam os potenciais benefcios de A. gorgonum.
Resumo:
A fidelidade da sntese proteica fundamental para a estabilidade do proteoma e para a homeostasia celular. Em condies fisiolgicas normais as clulas tm uma taxa de erro basal associada e esta muitas vezes aumenta com o envelhecimento e doena. Problemas na sntese das protenas esto associados a vrias doenas humanas e aos processos de envelhecimento. De facto, a incorporao de erros nas protenas devido a tRNAs carregados pelas aminoacil-tRNA sintetases com o amino cido errado causa doenas neurodegenerativas em humanos e ratos. Ainda no claro como que estas doenas se desenvolvem e se so uma consequncia directa da disrupo do proteoma ou se so o resultado da toxicidade produzida pela acmulao de protenas mal traduzidas ao nvel do ribossoma. Para elucidar como que as clulas eucariticas lidam com protenas aberrantes e agregados proteicos (stress proteotxico) desenvolvemos uma estratgia para destabilizar o proteoma. Para isso estabelecemos um sistema de erros de traduo em embries de peixe zebra que assenta em tRNAs mutantes capazes de incorporar erradamente serina nas protenas. As protenas produzidas neste sistema despoletam as vias de resposta ao stress, nomeadamente a via da ubiquitina-proteassoma (UPP ubiquitin protesome pathway) e a via do retculo endoplasmtico (UPR unfolded protein response). O stress proteotxico gerado pelos erros de traduo altera a expresso gnica e perfis de expresso de miRNAs, o desenvolvimento embrionrio e viabilidade, aumenta a produo de espcies reactivas de oxignio (ROS), leva ainda acumulao de agregados proteicos e disfuno mitocondrial. As malformaes embrionrias e fentipos de viabilidade que observmos foram revertidos por antioxidantes, o que sugere que os ROS desempenham papis importantes nos fentipos degenerativos celulares induzidos pela produo de protenas aberrantes e agregao proteica. Estabelecemos ainda uma linha de peixe zebra transgnica para o estudo do stress proteotxico. Este trabalho mostra que a destabilizao do proteoma em embries de peixe zebra com tRNAs mutantes uma boa metodologia para estudar a biologia do stress proteotxico visto que permite a agregao controlada do proteoma, mimetizando os processos de agregao de protenas que ocorrem naturalmente durante o envelhecimento e em doenas conformacionais humanas.
Resumo:
A Engenharia de Tecidos um domnio multidisciplinar que combina especialistas de mltiplos domnios, no sentido de se desenvolverem substitutos biolgicos para a regenerao, reparao ou restaurao de funes de rgos ou tecidos. A estratgia mais comum em engenharia de tecidos consiste na utilizao de matrizes de suporte (scaffolds) tridimensionais, biocompatveis, biodegradveis e altamente porosos, os quais servem de substrato fsico ao processo de adeso, proliferao e diferenciao celular. O objectivo deste trabalho de investigao centrou-se na produo e caracterizao de scaffolds de PCL e de PCL com partculas de biovidro, abordando um processo de biofabricao, que teve por base o princpio da extruso. Utilizou-se para tal um equipamento patenteado pelo Centro para o Desenvolvimento Rpido e Sustentado do Produto (CDRsp) designado Bioextruder. Trata-se de um sistema concebido para a produo de matrizes com ou sem encapsulamento de clulas, de uma forma automtica, flexvel e integrada. As estruturas obtidas caracterizaram-se quanto s propriedades trmicas, qumicas, morfolgicas e mecnicas. Realizaram-se ainda, testes de bioactividade e testes de degradao in vitro. Os resultados obtidos mostram que as condies de processamento no induzem qualquer alterao no que diz respeito s propriedades trmicas e qumicas dos materiais, que o aumento do teor de biovidro conduz a uma fragmentao da matriz polimrica num perodo de tempo mais curto, que os scaffolds obtidos apresentam uma geometria bem definida e uma distribuio de poros uniforme. Demonstra-se assim, que a combinao da matriz polimrica (PCL) com o biovidro, sob a forma de scaffolds promissora para aplicaes em Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa.
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Estrogens, such as 17-estradiol (E2) are essential for normal growth and differentiation of the mammary gland. There are two estrogen receptors (ERs), ER and ER which are ligand activated transcription factors. ER stimulates proliferation and is the single most powerful predictor of breast cancer prognosis and since 70% of breast cancers express ER, strategies to block this receptor are the primary breast cancer treatment. Unlike ER, the role of ER in breast cancer and its potential as alternative therapeutic target remains controversial, mainly due to the lack of correlation between results obtained in vitro and epidemiological studies. The aim of this thesis was to increase our understanding of the molecular and cellular mechanisms of estrogen signaling in normal and cancerous cells, in different cellular contexts and with focus on ER. In Paper I we characterized the effect of the flavone PD098059 - which is a commonly used MEK1 inhibitor - on activation of transcription by ER and ER. We found that the estrogenic effect of PD098059 is dose dependent in concentrations ranging from 1 10 M and that activation of transcription by ER is suppressed by the inhibitory effect of PD98059 on MEK1 at concentrations above 50 M. In agreement with its flavone nature, PD098059 had a much stronger effect on ER than on ER transcriptional activity. Therefore, use of this compound for the study of signalling events in cells expressing ER should be carefully considered. In Paper II we assessed the effect of ER agonists in vivo and administered under different conditions in vitro. In basal conditions, ER induced apoptosis; however, in vivo ER agonists stimulated proliferation and inhibited apoptosis. In vivo effects were reproduced in culture, by activation of MAPK/ERK pathway with epidermal growth factor or basement membrane extract. In addition, insulin signalling and PI3-K/AKT activation was necessary for stimulation of proliferation. These results suggest that the cellular context modulates ER activity. Manuscript presents preliminary work aimed at the set-up of a methodological strategy to isolate ERs and to identify interacting proteins in different cellular contexts and which could modulate the bi-phased effects of ER in cell growth. In conclusion, the studies presented in this thesis contribute to clarify the apparent contradictory information regarding ER function in normal and cancerous mammary epithelium and suggest that the cellular context should be considered when ER effects are studied.
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The genetic code is not universal. Alterations to its standard form have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes and demolished the dogma of an immutable code. For instance, several Candida species translate the standard leucine CUG codon as serine. In the case of the human pathogen Candida albicans, a serine tRNA (tRNACAGSer) incorporates in vivo 97% of serine and 3% of leucine in proteins at CUG sites. Such ambiguity is flexible and the level of leucine incorporation increases significantly in response to environmental stress. To elucidate the function of such ambiguity and clarify whether the identity of the CUG codon could be reverted from serine back to leucine, we have developed a forced evolution strategy to increase leucine incorporation at CUGs and a fluorescent reporter system to monitor such incorporation in vivo. Leucine misincorporation increased from 3% up to nearly 100%, reverting CUG identity from serine back to leucine. Growth assays showed that increasing leucine incorporation produced impressive arrays of phenotypes of high adaptive potential. In particular, strains with high levels of leucine misincorporation exhibited novel phenotypes and high level of tolerance to antifungals. Whole genome re-sequencing revealed that increasing levels of leucine incorporation were associated with accumulation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and loss of heterozygozity (LOH) in the higher misincorporating strains. SNPs accumulated preferentially in genes involved in cell adhesion, filamentous growth and biofilm formation, indicating that C. albicans uses its natural CUG ambiguity to increase genetic diversity in pathogenesis and drug resistance related processes. The overall data provided evidence for unantecipated flexibility of the C. albicans genetic code and highlighted new roles of codon ambiguity on the evolution of genetic and phenotypic diversity.
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The global aim of this thesis was to evaluate and assess the effects of a pesticide (dimethoate) and a metal (nickel), as model chemicals, within different organization levels, starting at the detoxification pathways (enzymatic biomarkers) and energy costs associated (energy content quantification, energy consumption and CEA) along with the physiological alterations at the individual and population level (mortality), leading to a metabolomic analysis (using liquid 1H-NMR) and finally a gene expression analysis (transcriptome and RT-qPCR analysis). To better understand potential variations in response to stressors, abiotic factors were also assessed in terrestrial isopods such as temperature, soil moisture and UV radiation. The evaluation performed using biochemical biomarkers and energy related parameters showed that increases in temperature might negatively affect the organisms by generating oxidative stress. It also showed that this species is acclimated to environments with low soil moisture, and that in high moisture scenarios there was a short gap between the optimal and adverse conditions that led to increased mortality. As for UV-R, doses nowadays present have shown to induce significant negative impact on these organisms. The long-term exposure to dimethoate showed that besides the neurotoxicity resulting from acetylcholinesterase inhibition, this stressor also caused oxidative stress. This effect was observed for both concentrations used (recommended field dose application and a below EC50 value) and that its combination with different temperatures (20C and 25C) showed different response patterns. It was also observed that dimethoates degradation rate in soils was higher in the presence of isopods. In a similar study performed with nickel, oxidative stress was also observed. But, in the case of this stressor exposure, organisms showed a strategy where the energetic costs necessary for detoxification (biomarkers) seemed to be compensated by positive alterations in the energy related parameters. In this work we presented for the first time a metabolomic profile of terrestrial isopods exposed to stressors (dimethoate and niquel), since until the moment only a previous study was performed on a metabolomic evaluation in nonexposed isopods. In the first part of the study we identify 24 new metabolites that had not been described previously. On the second part of the study a metabolomic profile variation of abstract non-exposed organism throughout the exposure was presented and finally the metabolomic profile of organisms exposed to dimethoate and nickel. The exposure to nickel suggested alteration in growth, moult, haemocyanin and glutathione synthesis, energy pathways and in osmoregulation. As for the exposure to dimethoate alterations in osmoregulation, energy pathways, moult and neurotransmission were also suggested. In this work it was also presented the first full body transcriptome of a terrestrial isopod from the species Porcellionides pruinosus, which will complement the scarce information available for this group of organisms. This transcriptome also served as base for a RNA-Seq and a RT-qPCR analysis. The results of the RNA-Seq analysis performed in organisms exposed to nickel showed that this stressor negatively impacted at the genetic and epigenetic levels, in the trafficking, storage and elimination of metals, generates oxidative stress, inducing neurotoxicity and also affecting reproduction. These results were confirmed through RT-qPCR. As for the impact of dimethoate on these organisms it was only accessed through RT-qPCR and showed oxidative stress, an impact in neurotransmission, in epigenetic markers, DNA repair and cell cycle impairment. This study allowed the design of an Adverse Outcome Pathway draft that can be used further on for legislative purposes.
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Bacterial infections are an increasing problem for human health. In fact, an increasing number of infections are caused by bacteria that are resistant to most antibiotics and their combinations. Therefore, the scientific community is currently searching for new solutions to fight bacteria and infectious diseases, without promoting antimicrobial resistance. One of the most promising strategies is the disruption or attenuation of bacterial Quorum Sensing (QS), a refined system that bacteria use to communicate. In a QS event, bacteria produce and release specific small chemicals, signal molecules - autoinducers (AIs) - into the environment. At the same time that bacterial population grows, the concentration of AIs in the bacterial environment increases. When a threshold concentration of AIs is reached, bacterial cells respond to it by altering their gene expression profile. AIs regulate gene expression as a function of cell population density. Phenotypes mediated by QS (QSphenotypes) include virulence factors, toxin production, antibiotic resistance and biofilm formation. In this work, two polymeric materials (linear polymers and molecularly imprinted nanoparticles) were developed and their ability to attenuate QS was evaluated. Both types of polymers should to be able to adsorb bacterial signal molecules, limiting their availability in the extracellular environment, with expected disruption of QS. Linear polymers were composed by one of two monomers (itaconic acid and methacrylic acid), which are known to possess strong interactions with the bacterial signal molecules. Molecularly imprinted polymer nanoparticles (MIP NPs) are particles with recognition capabilities for the analyte of interest. This ability is attained by including the target analyte at the synthesis stage. Vibrio fischeri and Aeromonas hydrophila were used as model species for the study. Both the linear polymers and MIP NPs, tested free in solutions and coated to surfaces, showed ability to disrupt QS by decreasing bioluminescence of V. fischeri and biofilm formation of A. hydrophila. No significant effect on bacterial growth was detected. The cytotoxicity of the two types of polymers to a fibroblast-like cell line (Vero cells) was also tested in order to evaluate their safety. The results showed that both the linear polymers and MIP NPs were not cytotoxic in the testing conditions. In conclusion, the results reported in this thesis, show that the polymers developed are a promising strategy to disrupt QS and reduce bacterial infection and resistance. In addition, due to their low toxicity, solubility and easy integration by surface coating, the polymers have potential for applications in scenarios where bacterial infection is a problem: medicine, pharmaceutical, food industry and in agriculture or aquaculture.
