37 resultados para BIOLOGIA CELULAR
Resumo:
As zonas costeiras, estuarinas e lagunares so consideradas reas muito produtivas e dotadas de grande biodiversidade sendo, por isso, consideradas de elevado valor ecolgico e econmico. No entanto, nas ltimas dcadas tem vindo a verificar-se um aumento da contaminao destes ecossistemas como resultado de diversas actividades antrpicas. As abordagens actualmente disponveis para avaliao do impacto da poluio em ecossistemas estuarinos e lagunares apresentam diversos tipos de lacunas, pelo que importante desenvolver metodologias mais eficazes com organismos autctones. Neste contexto, o objectivo central desta dissertao consistiu em desenvolver e validar mtodos ecologicamente relevantes para avaliao da contaminao estuarina e dos seus efeitos, utilizando o gbio-comum (Pomatoschistus microps), quer como organismo-teste quer como espcie sentinela, devido importante funo que desempenha nas cadeias trficas de diversos esturios da costa Portuguesa. A Ria de Aveiro foi seleccionada como rea de estudo principalmente pelo facto de possuir zonas com diferentes tipos de contaminao predominante e de haver conhecimento cientfico de base abundante e de elevada qualidade sobre este ecosistema. Na primeira fase do estudo, foram investigados os efeitos agudos de dois hidrocarbonetos aromticos policclicos (HAPs) (benzo[a]pireno e antraceno), de um fuel-leo e de dois metais (cobre e mercrio) em P. microps, utilizando ensaios laboratoriais baseados em biomarcadores e em parmetros comportamentais, os quais foram avaliados utilizando um dispositivo expressamente desenvolvido para o efeito, designado por speed performance device (SPEDE). Como biomarcadores foram utilizados parmetros envolvidos em funes fisiolgicas determinantes para a sobrevivncia e desempenho dos animais (neurotransmisso, obteno de energia, destoxificao e defesas anti-oxidantes), nomeadamente a actividade das enzimas acetilcolinesterase, lactato desidrogenase, CYP1A1, glutationa S-transferases, glutationa reductase, glutationa peroxidase, superxido dismutase, catalase, tendo ainda sido determinados os nveis de peroxidao lipdica como indicador de danos oxidativos. De forma global, os resultados indicaram que os agentes e a mistura testados tm a capacidade de interferir com a funo neurolgica, de alterar as vias utilizadas para obteno de energia celular, induzir as defesas antioxidantes e, no caso do cobre e do mercrio, de causarem peroxidao lipdica. Foram ainda obtidas relaes concentrao-resposta a nvel dos parmetros comportamentais testados, nomeadamente a capacidade de nadar contra a corrente e a distncia percorrida a nadar contra o fluxo de gua, sugerindo que os agentes testados podem, por exemplo, diminuir a capacidade de fuga aos predadores, as probabilidades de captura de presas e o sucesso reprodutivo. Na segunda fase, tendo sido j adaptadas tcnicas para determinao de vrios biomarcadores em P. microps e estudada a sua resposta a dois grupos de poluentes particularmente relevantes em ecossistemas estuarinos e lagunares (metais e HAPs), foi efectuado um estudo de monitorizao utilizando P. microps como bioindicador e que incluiu diversos parmetros ecolgicos e ecotoxicolgicos, nomedamente: 20 parmetros indicativos da qualidade da gua e do sedimento, concentrao de 9 metais em sedimentos e no corpo de P. microps, 8 biomarcadores e 2 ndices de condio na espcie seleccionada. A amostragem foi efectuada em quatro locais da Ria de Aveiro, um considerado como referncia (Barra) e trs com diferentes tipos predominantes de contaminao (Vagueira, Porto de Aveiro e Cais do Bico), sazonalmente, durante um ano. Os resultados obtidos permitiram uma caracterizao ecotoxicolgica dos locais, incluindo informao sobre a qualidade da gua, concentraes de contaminantes ambientais prioritrios nos sedimentos e nos tecidos de P. microps, capacidade desta espcie para bioacumular metais, efeitos exercidos pelas complexas misturas de poluentes presentes em cada uma das zonas de amostragem nesta espcie e possveis consequncias para a populao. A anlise multivariada permitiu analisar de forma integrada todos os resultados, proporcionando informao que no poderia ser obtida analisando os dados de forma compartimentalizada. Em concluso, os resultados obtidos no mbito desta dissertao indicam que P. microps possui caractersticas adequadas para ser utilizado como organismoteste em ensaios laboratoriais (e.g. abundncia, fcil manuteno, permite a determinao de diferentes tipos de critrios de efeito utilizando um nmero relativamente reduzido de animais, entre outras) e como organismo sentinela em estudos de monitorizao da poluio e da qualidade ambiental, estando portanto de acordo com estudos de menor dimenso previamente efectuados. O trabalho desenvolvido permitiu ainda adaptar a P. microps diversas tcnicas bioqumicas vulgarmente utilizadas como biomarcadores em Ecotoxicologia e valid-las quer no laboratrio quer em cenrios reais; desenvolver um novo bioensaio, utilizando um dispositivo de teste especialmente concebido para peixes epibentnicos baseado na performance natatria de uma espcie autctone e em biomarcadores; relacionar os efeitos a nvel bioqumico com parmetros comportamentais que ao serem afectados podem reduzir de forma drstica e diversificada (e.g. aumento da mortalidade, diminuio do sucesso reprodutivo, reduo do crescimento) a contribuio individual para a populao. Finalmente, foi validada uma abordagem multidisciplinar, combinando metodologias ecolgicas, ecotoxicolgicas e qumicas que, quando considerada de forma integrada utilizando anlises de estatstica multivariada, fornece informao cientfica da maior relevncia susceptvel de ser utilizada como suporte a medidas de conservao e gesto em esturios e sistemas lagunares.
Resumo:
A importncia de reas cientficas, como biologia e biotecnologia na vida humana cada vez mais reconhecida. Assim, necessrio que professores, actuais e futuros, e investigadores desenvolvam programas de formao/investigao orientados para a compreenso de contedos cientficos e questionamento da natureza destas reas e, simultaneamente, para utilizaes conscienciosas de conhecimento cientfico na vida prtica. neste quadro que se insere a investigao realizada e apresentada na presente dissertao. Para responder questo central:Como proporcionar formao em biologia e biotecnologia para o mundo contemporneo a alunos futuros professores de cincias?, a investigao envolveu dois percursos gerais de trabalho: i) Autoformao em biologia e biotecnologia vegetal numa perspectiva investigativa e ii) Desenvolvimento de percursos investigativos em formao inicial de professores de cincias para o Ensino Bsico, envolvendo temticas actuais relacionadas com biologia e biotecnologia. Globalmente, a investigao baseou-se em trs pressupostos: 1) oportuno e necessrio mobilizar conhecimentos oriundos da investigao cientfica actual em biologia e biotecnologia para conceber, planear e desenvolver actividades de formao inicial de professores de cincias, 2) O perfil profissional de professores envolvidos em formao inicial de professores de cincias deve integrar competncias cientficas, desenvolvidas em trabalho investigativo e 3). Aos alunos-futuros professores de cincias devem proporcionar-se oportunidades para desenvolverem reflexo epistemolgica e trabalho investigativo, para mobilizarem adequadamente conhecimento oriundo de investigao cientfica actual e desenvolverem competncias na tripla perspectiva de educao sobre cincias, pelas cincias e em cincias. A autoformao desenvolveu-se no mbito de dois projectos em biologia e biotecnologia vegetal, designadamente, Toxicidade do chumbo em alface, onde se testou o efeito do chumbo em alface (Lactuca sativa), e Micropropagao de zimbro, onde se implementaram metodologias de micropropagao/clonagem de uma espcie em risco em Porto Santo, Juniperus Phoenicea. O desenvolvimento de percursos investigativos, com e por alunos-futuros professores de cincias, efectuou-se no mbito de uma disciplina de um curso de licenciatura em Cincias da Natureza e Matemtica para o 2 ciclo do Ensino Bsico. Estes percursos compreenderam reflexo epistemolgica e o desenvolvimento de trabalho investigativo que envolveu um conjunto de estratgias e recursos, incorporando contedos de toxicologia ambiental e de biotecnologia vegetal numa perspectiva de inter-relaes cincia, tecnologia e sociedade. Os resultados relativos ao desenvolvimento destes percursos investigativos evidenciaram o interesse e importncia de se desenvolverem em temticas cientficas actuais e relevantes para o mundo contemporneo, como via de autoformao, por um lado, e como estratgia de formao de alunos-futuros professores de cincias, orientada por preocupaes de educao para o desenvolvimento sustentvel, por outro. Simultaneamente, permitiram que todos os intervenientes, em particular os alunos-futuros professores de cincias, aprofundassem conhecimentos sobre contextos e processos envolvidos em formao em biologia e biotecnologia para o mundo contemporneo e identificassem implicaes para a formao de professores. Permitiram, ainda, apontar sugestes para investigao futura neste domnio.
Resumo:
As plantas utilizam diversas estratgias de sinalizao para reconhecer e responder aos stresses ambientais. A maioria das vias de transduo de sinais partilham um sinal genrico, normalmente a modulao dos nveis intracelulares de Ca2+. Esta por sua vez pode iniciar uma cascata de fosforilao proteica que finalmente afecta as protenas directamente envolvidas na proteco celular ou culmina em factores de transcrio que vo determinar a resposta fisiolgica ao stresse. A percepo destes sinais e a compreenso de como estes podem activar as respostas adaptativas so factores-chave para a tolerncia das plantas a stresses abiticos. Um dos principais stresses abticos que restrigem o crescimento das plantas a presena de metais pesados. A produo de fitoquelatinas e a subsequente quelao dos metais o mecanismo mais conhecido de tolerncia ao stresse metlico em plantas. Fitoquelatinas (PCs) so pptidos com grupos tiol que so sintetizados atravs da transpeptidao da glutationa (GSH), pela aco da enzima fitoquelatina sintase (PCS). No entanto, at ao momento, as vias de sinalizao que levam sntese de fitoquelatinas e percepo do stresse metlico so pouco compreendidas. Dentro deste contexto, o presente trabalho foi elaborado com o intuito de elucidar a via de sinalizao atravs da qual o cdmio detectado pelas clulas vegetais e induz a sntese de PCs. Quase todos, os estudos de stresses abiticos em plantas apontam para o facto de a sua sinalizao se basear nos mesmos tipos de sinais moleculares, nomeadamente a sinalizao por clcio, a fosforilao proteica e a induo de espcies reactivas de oxignio (ROS). Trabalhos recentes sugerem que a sinalizao de PCs poder envolver todos estes parmetros. Assim, uma primeira abordagem foi efectuada para compreender a sntese de PCs na espcie Arabidopsis thaliana, atravs da monitorizao da actividade de enzimas relacionadas, a -EC sintetase, GSH sintetase e a PC sintase (PCS), assim como o tempo necessrio para o elongamento das PCs e a sua acumulao. Seguidamente, ao longo deste processo foi analisada a expresso de sinais especficos, associados com sinais de clcio, fosforilao proteica e sinalizao por ROS. A importncia destes factores na sntese de PCs foi tambm avaliada atravs do uso de moduladores farmacolgicos de clcio e fosfatases proteicas e tambm pela induo de stresse oxidativo. Os resultados demonstraram novos dados sobre o papel do clcio e da fosforilao proteica na produo de PCs e na sntese de GSH, revelando que a actvidade da PCS regulada por fosforilao e que a sinalizao de clcio pode mediar a sntese de GSH. O envolvimento da sinalizao de ROS na sntese de GSH, atrves de crosstalk com a sinalizao de clcio tambm foi proposta. Assim, os resultados aqui apresentados descrevem uma possvel via de sinalizao de cdmio nas plantas e da induo de fitoquelatinas. Este trabalho poder ser portanto muito til na implementao de novas metodologias de agricultura sustentvel e prticas de fitorremediao em solos contaminados com metais pesados.
Resumo:
As protenas existentes nas clulas so produzidas pelo mecanismo de traduo do mRNA, no qual a informao gentica contida nos genes descodificada em cadeias polipeptdicas. O cdigo gentico, que define as regras de descodificao do genoma, minimiza os erros de traduo do mRNA, garantindo a sntese de protenas com elevada fidelidade. Esta essencial para a estabilidade do proteoma e para a manuteno e funcionamento dos processos celulares. Em condies fisiolgicas normais, os erros da traduo do mRNA ocorrem com frequncias que variam de 10-3 a 10-5 erros por codo descodificado. Situaes que aumentam este erro basal geralmente esto associadas ao envelhecimento, stresse e a doenas; no entanto, em certos organismos o cdigo gentico traduzido naturalmente com elevado erro, indicando que a sntese de protenas aberrantes pode de algum modo ser vantajosa. A fim de estudar a resposta celular aos erros de traduo do mRNA, construmos leveduras que incorporam serina no proteoma em resposta a um codo de leucina, usando a expresso constitutiva de um tRNASer mutante. Este fenmeno gentico artificial provocou uma forte diminuio da esporulao, da viabilidade e da eficincia de mating, afectando imensamente a reproduo sexual da levedura. Observou-se tambm uma grande heterogeneidade no tamanho e na forma das clulas e elevada instabilidade genmica, com o aparecimento de populaes poliplides e aneuplides. No sentido de clarificar as bases celulares e moleculares daqueles fentipos e compreender melhor a biologia do erro de traduo do mRNA, construmos tambm clulas de levedura que inserem serina em resposta a um codo de leucina de modo indutvel e controlado. Utilizaram-se perfis de mRNA total e de mRNA associado a polissomas para elucidar a resposta celular ao erro de traduo do mRNA. Observou-se a induo de genes envolvidos na resposta ao stresse geral, stresse oxidativo e na unfolded protein response (UPR). Um aumento significativo de espcies reactivas de oxignio (ROS) e um forte impacto negativo na capacidade das clulas ps-mitticas re-iniciarem o crescimento foram tambm observados. Este fentipo de perda de viabilidade celular foi resgatado por scavangers de ROS, indicando que o stresse oxidativo a principal causa de morte celular causada pelos erros de traduo. Este estudo levanta a hiptese de que o stresse oxidativo e a acumulao de ROS, ao invs do colapso sbito do proteoma, so as principais causas da degenerao celular e das doenas humanas associadas aos erros de traduo do genoma. ABSTRACT: Proteins are synthesized through the mechanism of translation, which uses the genetic code to transform the nucleic acids based information of the genome into the amino acids based information of the proteome. The genetic code evolved in such a manner that translational errors are kept to a minimum and even when they occur their impact is minimized by similar chemical properties of the amino acids. Protein synthesis fidelity is essential for proteome stability and for functional maintenance of cellular processes. Indeed, under normal physiological conditions, mistranslation occurs at frequencies that range from 10-3 to 10-5 errors per codon decoded. Situations where this basal error frequency increases are usually associated to aging and disease. However, there are some organisms where genetic code errors occur naturally at high level, suggesting that mRNA mistranslation can somehow be beneficial. In order to study the cellular response to mRNA mistranslation, we have engineered single codon mistranslation in yeast cells, using constitutive expression of mutant tRNASer genes. These mistranslating strains inserted serines at leucine-CUG sites on a proteome wide scale due to competition between the wild type tRNALeu with the mutant tRNASer. Such mistranslation event decreased yeast sporulation, viability and mating efficiencies sharply and affected sexual reproduction strongly. High heterogeneity in cell size and shape and high instability in the genome were also observed, with the appearance of some polyploid or aneuploid cell populations. To further study the cellular and molecular basis of those phenotypes and the biology of mRNA mistranslation, we have also engineered inducible mRNA misreading in yeast and used total mRNA and polysome associated mRNA profiling to determine whether codon misreading affects gene expression. Induced mistranslation up-regulated genes involved in the general stress response, oxidative stress and in the unfolded protein response (UPR). A significant increase in reactive oxygen species (ROS) and a strong negative impact on the capacity of post-mitotic cells to re-initiate growth in fresh media were also observed. This cell viability phenotype was rescued by scavengers of ROS, indicating that oxidative stress is the main cause of cell death caused by mRNA mistranslation. This study provides strong support for the hypothesis that oxidative stress and ROS accumulation, rather than sudden proteome collapse or major proteome disruption, are the main cause of the cellular degeneration observed in human diseases associated mRNA mistranslation.
Resumo:
Os dinoflagelados so um grupo muito diverso de protistas que possuem um conjunto de caractersticas pouco comuns. Os peridiniides so dinoflagelados com teca que formada por seis sries latitudinais de placas, incluindo a srie cingular e um anel incompleto de placas intercalares anteriores, embora as ltimas estejam ausentes em algumas espcies de Peridiniopsis. So dinoflagelados com simetria bilateral em relao ao plano apical que contem o eixo dorso-ventral. Na srie sulcal h apenas uma placa posterior que contacta com o limite ventral de duas grandes placas antapicais. Entre os peridiniides, a presena ou ausncia de um poro apical e o nmero de placas no cngulo so geralmente consideradas marcas filogenticas importantes ao nvel de gnero ou famlia. Actualmente, a definio de Peridinium Ehrenberg, o dinoflagelado mais comum de gua doce, inclui organismos com combinaes diferentes destas duas caractersticas. Trabalhos anteriores sobre a ultrastrutura e afinidade filogentica das espcies tipo de Peridinium, P. cinctum, e Peridiniopsis Lemmermann, P. borgei tambm sugerem a necessidade de reexaminar as relaes taxonmicas dos peridiniides. Esta tese combina o estudo ultrastrutural de uma seleco de espcies com hipteses filogenticas baseadas nas sequncias de LSU rDNA, para aumentar o nosso conhecimento das diferenas e afinidades dentro dos peridiniides. Tem como objectivo aumentar o nosso conhecimento das caractersticas individuais das clulas que possam levar a reconhecer sinapomorfias que possam ser usadas como marcadores dos peridiniides como um todo e dos seus subgrupos. As espcies escolhidas para exame pormenorizado foram: Peridinium palatinum Lauterborn, de um grupo com duas placas intercalares anteriores, seis placas cingulares e sem poro apical; Peridinium lomnickii Wo!oszy"ska, de um grupo com poro apical, trs placas intercalares e seis cingulares; Peridiniopsis berolinensis (Lemmermann) Bourrelly, uma espcie heterotrfica com poro apical, sem placas intercalares e com seis placas cingulares; e Sphaerodinium cracoviense Wo!oszy"ska, um membro de um gnero de formas com teca com um tipo de tabulao marginalmente peridiniide, com um suposto poro apical e quatro placas intercalares anteriores. Peridinium palatinum difere de Peridinium e Peridiniopsis tpicos, quer em caractersticas da teca, quer internas. As diferenas estimadas entre as sequncias parciais de LSU rDNA de P. palatinum e a espcie prxima P. pseudolaeve, relativamente a P. cinctum so comparativamente grandes e, juntamente com a topologia da rvore filogentica, apoiam a separao de P. palatinum e formas prximas ao nvel de gnero. Palatinus nov. gen. foi, ento, descrito com as novas combinaes Palatinus apiculatus nov. comb. (espcie tipo; sin. Peridinium palatinum), P. apiculatus var. laevis nov. comb. e P. pseudolaevis nov. comb.. As caractersticas distintivas de Palatinus incluem uma superfcie das placas lisa ou um tanto granulosa, mas no areolada, um grande pirenide central penetrado por canais citoplasmticos e de onde radiam lobos plastidiais, e a presena de uma fiada microtubular homloga de um pednculo. As clulas de Palatinus saem da teca pela zona antapicalpos- cingular. Peridinium lomnickii apresenta tabulao semelhante s formas marinhas, produtoras de quistos calcrios, do gnero Scrippsiella A.R. Loeblich. Para comparao, adicionmos novas observaes ultrastruturais de S. trochoidea. Peridinium lomnickii tem uma combinao de caractersticas diferente de Peridinium, Peridiniopsis e Scrippsiella. As hipteses filogenticas baseadas em DNA colocam P. lomnickii no mesmo ramo que Pfiesteria Steidinger et Burkholder, Tyrannodinium e outras Pfiesteriaceae, com as quais partilha um "microtubular basket" e uma ligao peculiar entre duas placas do sulco. As caractersticas distintivas do novo gnero proposto Chimonodinium gen. ined. incluem, alm da tabulao, a ausncia de pirenides, a presena de um "microtubular basket" com quatro ou cinco fiadas sobrepostas de microtbulos associados a um pequeno pednculo, um sistema pusular com tubos pusulares bem definidos ligados aos canais flagelares, e a produo de quistos no calcrios. Peridiniopsis berolinensis partilha vrias caractersticas significativas com Pfiesteria e afins, como um "microtubular basket" com a capacidade de suportar um tubo de alimentao, quimiossensibilidade para encontrar presas apropriadas, o modo de natao junto s presas e a organizao geral da clula. Hipteses filogenticas com base em LSU rDNA confirmam a afinidade entre P. berolinensis e Pfiesteria bem como a relao mais remota com a espcie tipo de Peridiniopsis, P. borgei. Estas razes justificam a proposta de Tyrannodinium gen. nov., uma nova Pfiesteriaceae que difere de outros membros do grupo por viver em gua doce e nos pormenores da tabulao. Sphaerodinium cracoviense revelou a tabulao tpica do gnero Sphaerodinium, que apresenta um nmero de placas intercalares superiores e pos-cingulares maior que o que tpico em peridiniides: 4 e 6, respectivamente. Observaes em SEM mostraram uma estrutura apical diferente da dos peridiniides, e um sulco apical numa das placas fazendo lembrar a rea apical de alguns woloszynskiides. Os pormenores do aparelho flagelar e do sistema pusular ligam o Sphaerodinium aos woloszynskiides em geral e ao gnero Baldinia em particular, mas no aos peridiniides. O volumoso estigma de S. cracoviense revelou ser extraplastidial e de um modelo nico, composto por elementos que se encontram em woloszynskiides, mas nunca encontrados anteriormente juntos. A anlise filogentica baseada nas sequncias parciais de LSU rDNA tambm sugerem uma maior proximidade de S. cracoviense com os woloszynskiides do que com os peridiniides. Futuras anlises pormenorizadas de dinoflagelados peridiniides, em especial entre os do numeroso grupo de espcies com poro apical, sero necessrias para clarificar as suas relaes taxonmicas; e a produo de descries melhoradas das caractersticas finas particulares das clulas sero um requisito para perceber a evoluo dos caracteres dos peridiniides por forma a podermos identificar marcadores filogenticos.
Resumo:
Devido s actividades antropognicas vrias substncias qumicas tm sido introduzidas no meio ambiente em concentraes que de outro modo no ocorreriam de forma to elevada naturalmente. Assim, o conhecimento acerca das caractersticas de um qumico, tais como, o potencial para se acumular em diferentes nveis trficos, a sua mobilidade dentro do ecossistema, a toxicidade especfica e a bioacumulao, fundamental para compreender os seus efeitos nos ecossistemas. Esta tese investiga a influncia de especiao, na biodisponibilidade do cdmio (Cd) para o ispode Porcellio dilatatus, incluindo os efeitos de especiao do metal: (i) na assimilao do Cd, (ii) no modo como o Cd se distribui internamente no organismo, e (iii) como a sobrevivncia e a reproduo so afectadas em ispodes terrestres. Num primeiro ensaio laboratorial avaliou-se a importncia da transferncia trfica na assimilao do Cd em P. dilatatus. Para tal analisou-se a eficincia de assimilao (EA) do Cd em ispodes, adicionado superficialmente ao alimento (alface) na forma de Cd(NO3)2 e contaminando o meio de crescimento da alface. A hiptese era de que a alface contaminada biologicamente atravs do cultivo em meio hidropnico contaminado teria uma maior proporo de complexos com protena ou conjugado na forma de Cd (ex. Cd cistena). A EA de Cd foi maior entre os ispodes que foram alimentados com o sal (71%, SE = 7%), do que entre os ispodes que se alimentaram de alface contaminada biologicamente (52%, SE = 5%), demonstrando-se assim num teste laboratorial que provvel que a especiao do Cd influencie a taxa de assimilao e acumulao do Cd. Na experincia alimentar que se seguiu, estudou-se em detalhe a especiao do metal comparando as EA do Cd conjugado com cistena (Cd(Cys)2) e na forma de Cd(NO3)2, com os quais se contaminou gelatina com alface. A utilizao de Cd-cistena, proporcionou uma forma experimental para explorar a biodisponibilidade do Cd complexado dentro do tecido biolgico. Como esperado, a EA de Cd em ispodes alimentados com nitrato de Cd (64%, SE = 5%) foi maior do que no caso de ispodes alimentados com o conjugado de cistena (20%, SE = 3%). De seguida estudou-se a distribuio subcelular das espcies de Cd assimilado atravs de um processo de fraccionamento. Supunha-se que as diferenas de especiao de Cd reflectiria diferentes estratgias de compartimentalizao, com consequncias ao nvel da detoxificao, armazenamento celular e distribuio subcelular do metal. O sequestro na forma de metal biologicamente detoxificado (BDM = protenas estveis ao calor - HSP e grnulos ricos em metal - RMG) foi maior nos ispodes alimentados com Cd(NO3)2, sugerindo que so mais eficientes na detoxificao de Cd (22%) do que quando alimentados com Cd(Cys)2 (15%). Foi tambm demonstrado que os ispodes alimentados com Cd(Cys)2 possuam nveis de armazenamento de Cd superior nas fraces sensveis ao metal (MSF = organelos e protenas desnaturadas pelo calor - HDP) consideradas fraces potencialmente vulnerveis e afectando os ispodes em termos de toxicidade. As diferentes distribuies internas que se seguiram assimilao e detoxificao das diferentes espcies de Cd foram finalmente avaliadas em termos da sobrevivncia e reproduo dos ispodes. O tratamento com Cd(Cys)2 teve maior mortalidade, provavelmente devido maior disponibilidade de Cd ingerido com implicaes ao nvel dos processos fisiolgicos. Os ispodes alimentados com Cd(NO3)2 armazenaram o Cd nos MRG, como estratgia de detoxificao, sendo mais eficientes a detoxificar o Cd ainda que aumentando a concentrao total do metal que se tornou menos txico para o ispode. Desta forma, o Cd nos grnulos no estava disponvel para os processos fisiolgicos e deixou de ser txico. Isso poderia estar relacionado com a resistncia e tolerncia aos metais devido capacidade dos ispodes compartimentalizarem o Cd no hepatopncreas, que actua como um mecanismo de detoxificao e contribui para a tolerncia a altos nveis de cdmio. Em termos de parmetros reprodutivos, observou-se uma reduo de gestaes e durao da gestao na presena de ambas as espcies de metal, mas no caso do Cd(Cys)2 as gravidezes no se concluram. O nmero de jovens produzido por fmeas alimentadas com Cd(NO3)2 foi menor do que no controlo, mas os pesos dos juvenis foram superiores. Finalmente sugere-se assim que esta abordagem seja considerada em estudos do movimento trfico de metais nas cadeias alimentares dado que se espera que a especiao de metais implique diferentes fluxos, dentro de uma dada cadeia trfica.
Resumo:
A gnese de um cancro est dependente da acumulao de mutaes genticas que do origem a instabilidade genmica, que por sua vez resulta na proliferao descontrolada. Para prevenir a acumulao destas mutaes, as clulas tm mecanismos de controlo (checkpoints) que suspendem o ciclo celular e accionam as vias de reparao do ADN. Estes eventos so muitas vezes regulados por dinmicas de (des)fosforilao de protenas. As protenas fosfatases (PPs), enzimas responsveis pela remoo do grupo fosfato de resduos fosforilados, desempenham funes cruciais na regulao de muitos mecanismos celulares. Enquanto que no incio do projecto as cinases envolvidas no checkpoint da replicao estavam bem estabelecidas, as PPs envolvidas no eram conhecidas. A Chk1, um componente da maquinaria do checkpoint da replicao, exemplo dessa regulao por (des)fosforilao, como sejam nos resduos Ser317 e Ser345. Assim, como primeira abordagem para determinar quais os grupos de PPs envolvidos na regulao do checkpoint da replicao, decidimos investigar o seu papel na regulao da fosforilao da Chk1. A primeira concluso que a desfosforilao da Chk1 ao longo do tempo, tanto in vivo como in vitro, ocorre com uma dinmica bi-fsica. Em segundo, a abordagem in vitro sugere que as famlias PP1, PP2A e PP2C esto envolvidas na desfosforilao da Chk1. Uma vez que a famlia PP2A foi a que mostrou a maior aco nesta reaco, decidimos investigar outros membros da famlia in vivo, primeiro com uma abordagem geral (tratando com OA ou sobreexpressando a PME-1), e depois com o knockdown especfico da PP4 e PP6 (atravs de siRNA). Os resultados mostram que a inibio das PPs afectam tanto a desfosforilao como o estado de activao da Chk1 em resposta a tratamento com Hidroxiureia (HU). Todas as PPs testadas in vivo pareceram ser capazes de regular, a nveis diferentes, tanto a fosforilao como a desfosforilao da Chk1. A funo das PPs foi tambm investigada ao nvel: da regulao do disparo das origens de replicao, e da recuperao da suspenso da replicao, induzida pela HU. No ltimo caso, os dados indicam que na situao simultnea de knockdown da PP4 com tratamento de HU, h um atraso do ciclo celular na resoluo da transio de G2/M. No ensaio de replicao por pulse-chase, os resultamos mostram que tanto o tratamento com OA, como a sobre-expresso de I-2 ou PME-1, atrasam a cronologia do disparo programado das origens de replicao. No entanto, nenhum dos tratamentos efectuados parece desregular o incio do checkpoint da replicao. Um rastreio de 2-hbrido de levedura com uma biblioteca de cDNA de testculo humano foi realizado, usando a Chk1 como isco, no sentido de descobrir novos interactores e definir novas possveis funes para a Chk1 no contexto da meiose. Com base nos resultados do rastreio, duas novas funes so sugeridas: a interaco com a GAGE12 sugere uma funo na recombinao genmica/vigilncia do genoma durante a meiose, e as interaces com a EEF11 e a RPS5 sugerem uma funo na regulao da sntese proteca. Estas experincias fornecem um viso geral para a compreenso da diversidade de funes das protenas fosfatases envolvidas no checkpoint da replicao, bem como, abre novos caminhos para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento do cancro.
Resumo:
A estirpe Bacillus licheniformis I89 possui a capacidade de produzir alguns compostos com actividade antibacteriana. No presente estudo, a separao desses compostos foi realizada atravs da aplicao de vrios procedimentos, incluindo extraco em fase slida e cromatografia liquida de alta presso. Dois destes compostos bioactivos constituem o lantibitico de classe II lichenicidina e so caracterizados pela massas molecular de 3250 Da (Bli) e 3020 Da (Bli). O cluster responsvel pela biossntese da lichenicidina foi heterologamente expresso em Escherichia coli, constituindo a primeira descrio da produo de um lantibitico totalmente in vivo num hospedeiro Gram-negativo. Este sistema foi subsequentemente explorado com o objectivo de relacionar cada protena codificada no cluster gentico da lichenicidina na produo dos pptidos Bli e Bli. O desenvolvimento do sistema de trans complementao possibilitou a produo de variantes destes pptidos. A anlise das massas moleculares destas variantes assim como a anlise dos padres de fragmentao obtidos por MS/MS permitiu a reviso de algumas das caractersticas estruturais previamente proposta para Bli e Bli. A anlise dos genes hipoteticamente envolvidos na proteco da estirpe produtora contra a aco antibitica da lichenicidina revelou, que em E. coli, a sua ausncia no resulta no aumento da susceptibilidade a este composto. Verificou-se tambm que a presena destes genes no essencial para a produo de lichenicidina em E. coli. Foi tambm confirmado experimentalmente que a membrana externa da E. coli constitui uma barreira natural para a entrada dos pptidos na clula. De facto, uma das caractersticas intrigantes da produo de lichenicidina por uma bactria de Gram negativo reside no mecanismo de transporte dos dois pptidos atravs da membrana externa. Neste estudo foi demonstrado que na ausncia da protena de membrana TolC, a massa molecular de Bli e Bli no foi identificada no sobrenadante de E. coli, demonstrando assim que a sua presena no ambiente extra-celular no se devia a um processo de lise bacteriana. Foi ainda avaliada a capacidade da maquinaria biossinttica da lichenicidina para produzir o lantibitico haloduracina, atravs do processamento de chimeras lichenicidina-haloduracina, contudo, os resultados foram negativos. Verificou-se ainda que em determinadas condies de incubao, a diferenciao da morfologia original da estirpe B. licheniformis I89 pode ocorrer. Esta dissociao implicou a transio da colnia parental e rugosa para uma colnia de aparncia mais simples e suave. Desta forma, as diferenas das duas morfologias em termos de taxa de crescimento, esporulao e actividade antibitica foram investigadas. Considerando especificamente Bli e Bli verificou-se que a abundncia destes pptidos nas culturas do fentipo fino geralmente inferior aquela identificada nas culturas do fentipo parental. Por ltimo, a diversidade de elementos genticos constituintes de pptido sintetases no ribossomais (NRPS) foi investigada em lagoas no centro de Portugal e em solos provenientes de caves do sul de Portugal, revelando a presena de potenciais novas NRPS nestes ambientes.
Resumo:
O presente trabalho prope-se esclarecer o papel que a progesterona e os seus metabolitos exercem no sistema nervoso central. Nos ltimos anos, com a descoberta da sntese local de esterides no crebro, a progesterona, assim como outras hormonas sexuais, ganharam uma relevncia crescente em fenmenos tais como plasticidade neuronal e neuroproteco. Ainda que j se comece a entender o papel de muitas hormonas no crebro, tal como o estrognio, o papel da progesterona continua menos conhecido. Deste modo, o nosso trabalho centrou-se na elucidao dos efeitos da progesterona em fenmenos de sobrevivncia celular, plasticidade neuronal/sinptica. Graas colaborao com um grupo pioneiro em estudos sobre hormonas sexuais neuroactivas, o presente trabalho fornece uma importante contribuio ao entendimento do papel desta hormona no sistema nervoso central. Este trabalho fornece novos dados, relativamente ao papel da progesterona e dos seus metabolitos reduzidos na regulao de vias de sinalizao associadas com sobrevivncia celular, tal como Akt/PI3K e ERK. Tambm analisado o efeito do tratamento hormonal na expresso e estado de fosforilao da protena Tau, sendo ainda motivo de estudo cinases e fosfatases envolvidas nestes mecanismos.
Resumo:
A discondroplasia da tbia (TD) em aves consiste numa anomalia do esqueleto onde existe uma falha nos processos normais da ossificao endocondral. Esta patologia caracterizada pela formao de uma cartilagem no vascularizada e no mineralizada que se estende at metfise. Uma vez que existem vrias anomalias do esqueleto em mamferos com leses semelhantes s apresentadas pela TD, este trabalho teve como objectivo a caracterizao desta patologia em termos das molculas que podem estar envolvidas no seu desenvolvimento. Assim, foi estudada a expresso das macromolculas da matriz extracelular, das enzimas degradadoras da matriz (metaloproteinases da matriz: MMPs), bem como das molculas envolvidas na proliferao e diferenciao celular, na angiognese e apoptose. A expresso gnica foi realizada, por PCR quantitativo em tempo real, em placas de crescimento normais e discondroplsicas obtidas a partir de frangos de carne (broilers) da estirpe Cobb. Os nveis proteicos de algumas MMPs foram analisados por immunoblotting e zimografia de gelatina. No presente estudo no se verificou alterao na expresso dos genes dos colagnios do tipo II, IX, X e XI, bem como do agrecano, nas leses discondroplsicas. Observou-se uma reduo acentuada nos nveis de mRNA da gelatinase-B (MMP-9), da colagenase-3 (MMP-13) e das estromalisinas -2 (MMP-10) e -3 (MMP-11), bem como nos nveis proteicos da gelatinase-A (MMP-2) e da MMP-13. Por outro lado, a MMP-7 aumentou drasticamente a expresso do seu gene. As molculas envolvidas na proliferao e diferenciao dos condrcitos, tais como a PTHrP, o Ihh, o Cbfa-1 e o Sox-9, mantiveram a sua expresso gnica nas leses. Por outro lado, o TGF- reduziu a sua expresso. A caspase-3 tambm dimimuiu a sua expresso na patologia. Em relao aos factores angiognicos, o FGF manteve a sua expresso e o VEGF aumentou significativamente nas leses. Este aumento do VEGF juntamente com o aumento da MMP-7 sugere um aumento da hipoxia nas leses. Os nossos resultados sugerem que a acumulao da cartilagem observada na discondroplasia devida a uma diminuio da protelise da matriz, resultado de uma sub-expresso das MMPs, e no de um aumento da produo das macromolculas da matriz. Desta forma, os nossos resultados sugerem que a falha na expresso e/ou activao das MMPs poder estar associada ao desenvolvimento da discondroplasia da tbia em aves. Finalmente, os nossos resultados vm suportar os resultados anteriores que sugerem uma ligao entre a expresso das MMPs e anomalias no processo de ossificao endocondral.
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A protena precursora de amilide de Alzheimer (APP) um factor chave na doena de Alzheimer (AD). Essencialmente o processamento da APP resulta na produo de Abeta, o peptdeo txico depositado nas placas de amilide dos indivduos com AD. Ainda permanece por esclarecer se o processamento da APP afectado sob condies de stress celular, potencialmente aumentando a quantidade de Abeta produzida. Alm disso, o stress celular pode induzir alteraes moleculares, associadas AD, que podem representar marcadores moleculares teis para o diagnstico da AD. Com estas questes em mente, procurmos identificar alteraes, em resposta ao stress celular, no processamento da APP e na expresso de outras protenas. Nestes estudos de monitorizao considermos que a fosforilao proteica anormal e o stress oxidativo podem contribuir para a condio patolgica. Assim, investigmos o processamento da APP dependente da fosforilao durante o stress celular. Os dados obtidos confirmam que a secreo da APP reduzida em situaes de stress, e que o efeito idntico em linhas celulares de tipo neuronal e no neuronal. Os resultados obtidos revelam que o PMA, mesmo em situaes de stress (azida de sdio 1 mM) pode afectar o processamento da APP, aumentando a produo de sAPP (o fragmento secretado aps o processamento de APP) que pode potencialmente reduzir a produo de Abeta. A hiptese de afectar a produo de Abeta dependente da fosforilao, que por sua vez pode ter relevncia num quadro clnico, mantm-se mesmo em condies de stress. Os resultados revelaram que a induo de sAPP, aps a adio de steres de forbol, ou cido ocadeco, em condies de stress no idntica. Em contraste, sob condies controlo, tanto os steres de forbol como o cido ocadeco produzem o mesmo efeito em termos da produo de sAPP. Aparentemente estas duas vias podem ser dissociadas em condies de stress, o que de algum modo pode reflectir processamento alterado da APP em condies adversas. Nas experincias em que se analisou a expresso de outros potenciais marcadores moleculares, foram detectadas alteraes nos nveis de expresso de vrias protenas. Estes marcadores moleculares representam alvos interessantes para futura validao e potenciais candidatos para um diagnstico molecular na AD. As protenas j identificadas so importantes do ponto de vista da transduo de sinais, e incluem a PP1, a HSP70, a PARP e a prpria APP.
Resumo:
O conhecimento de mecanismos de genmica funcional tem sido maioritariamente adquirido pela utilizao de organismos modelo que so mantidos em condies laboratoriais. Contudo, estes organismos no reflectem as respostas a alteraes ambientais. Por outro lado, vrias espcies, ecologicamente bem estudadas, reflectem bem as interaces entre genes e ambiente mas que, das quais no existem recursos genticos disponveis. O imposex, caracterizado pela superimposio de caracteres sexuais masculinos em fmeas, induzido pelo tributilestanho (TBT) e trifenilestanho (TPT) e representa um dos melhores exemplos de disrupo endcrina com causas antropognicas no ambiente aqutico. Com o intuito de elucidar as bases moleculares deste fenmeno, procedeu-se combinao das metodologias de pirosequenciao (sequenciao 454 da Roche) e microarrays (Agilent 4*180K) de forma a contribuir para um melhor conhecimento desta interaco gene-ambiente no gastrpode Nucella lapillus, uma espcie sentinela para imposex. O trancriptoma de N. lapillus foi sequenciado, reconstrudo e anotado e posteriormente utilizado para a produo de um array de nucletidos. Este array foi ento utilizado para explorar nveis de expresso gnica em resposta contaminao por TBT. Os resultados obtidos confirmaram as hipteses anteriormente propostas (esteridica, neuroendcrina, retinica) e adicionalmente revelou a existncia de potenciais novos mecanismos envolvidos no fenmeno imposex. Evidncia para alvos moleculares de disrupo endcrina no relacionados com funes reprodutoras, tais como, sistema imunitrio, apoptose e supressores de tumores, foram identificados. Apesar disso, tendo em conta a forte componente reprodutiva do imposex, esta componente funcional foi a mais explorada. Assim, factores de transcrio e receptores nucleares lipoflicos, funes mitocondriais e actividade de transporte celular envolvidos na diferenciao de gneros esto na base de potenciais novos mecanismos associados ao imposex em N. lapillus. Em particular, foi identificado como estando sobre-expresso, um possvel homlogo do receptor nuclear peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR), cuja funo na induo de imposex foi confirmada experimentalmente in vivo aps injeco dos animais com Rosiglitazone, um conhecido ligando de PPAR em vertebrados. De uma forma geral, os resultados obtidos mostram que o fenmeno imposex um mecanismo complexo, que possivelmente envolve a cascata de sinalizao envolvendo o receptor retinoid X (RXR):PPAR heterodimer que, at data no foi descrito em invertebrados. Adicionalmente, os resultados obtidos apontam para alguma conservao de mecanismos de aco envolvidos na disrupo endcrina em invertebrados e vertebrados. Finalmente, a informao molecular produzida e as ferramentas moleculares desenvolvidas contribuem de forma significativa para um melhor conhecimento do fenmeno imposex e constituem importantes recursos para a continuao da investigao deste fenmeno e, adicionalmente, podero vir a ser aplicadas no estudo de outras respostas a alteraes ambientais usando N. lapillus como organismo modelo. Neste sentido, N. lapillus foi tambm utilizada para explorar a adaptao na morfologia da concha em resposta a alteraes naturais induzidas por aco das ondas e pelo risco de predao por caranguejos. O contributo da componente gentica, plstica e da sua interaco para a expresso fenotpica crucial para compreender a evoluo de caracteres adaptativos a ambientes heterogneos. A contribuio destes factores na morfologia da concha de N. lapillus foi explorada recorrendo a transplantes recprocos e experincias laboratoriais em ambiente comum (com e sem influncia de predao) e complementada com anlises genticas, utilizando juvenis provenientes de locais representativos de costas expostas e abrigadas da aco das ondas. As populaes estudadas so diferentes geneticamente mas possuem o mesmo caritipo. Adicionalmente, anlises morfomtricas revelaram plasticidade da morfologia da concha em ambas as direces dos transplantes recprocos e tambm a reteno parcial, em ambiente comum, da forma da concha nos indivduos da F2, indicando uma correlao positiva (co-gradiente) entre heritabilidade e plasticidade. A presena de estmulos de predao por caranguejos estimulou a produo de conchas com labros mais grossos, de forma mais evidente em animais recolhidos de costas expostas e tambm provocou alteraes na forma da concha em animais desta provenincia. Estes dados sugerem contra-gradiente em alteraes provocadas por predao na morfologia da concha, na produo de labros mais grossos e em nveis de crescimento. O estudo das interaces gene-ambiente descritas acima demonstram a actual possibilidade de produzir recursos e conhecimento genmico numa espcie bem caracterizada ecologicamente mas com limitada informao genmica. Estes recursos permitem um maior conhecimento biolgico desta espcie e abriro novas oportunidades de investigao, que at aqui seriam impossveis de abordar.
Resumo:
Com o presente trabalho pretendeu-se determinar e compreender melhor quais os alvos do Alumnio (Al) nas plantas, e contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos de tolerncia presentes em gentipos com elevado grau de tolerncia ao Al. O Al um dos maiores constituintes do solo e torna-se biodisponvel em solos com baixo pH. Nesses casos, a exposio ao Al afecta negativamente o crescimento das plantas conduzindo a uma diminuio da produo. Estes factos so especialmente visveis nos cereais, sendo a exposio ao Al uma das principais causas das quebras de produo nestas espcies. O Captulo I consiste numa reviso geral sobre a toxicidade do Al nas plantas, apontando os seus principais alvos. Apresenta tambm os mecanismos de resistncia, que inclui Al-destoxificao externa e interna, em diferentes espcies. O Captulo II aborda os estudos sobre a exposio de curto prazo ao Al em duas espcies de cereais: Triticum aestivum L. e Secale cereale L., tendo-se sempre utilizado um gentipo Al-tolerante e um Al-sensvel para cada espcie. Este captulo est dividido em trs estudos: no Captulo II.1 reala-se o efeito da exposio a 185 M de Al no equilbrio nutricional em trigo. Verificou-se que em ambos os gentipos (sensvel e tolerante) o perfil de macro e micro nutrientes se alterou, tendo uma interferncia negativa, sobretudo no nvel de P, Mg e K. Alm disso, registaram-se diferenas na diferenciao da endoderme consoante o grau de tolerncia/sensibilidade do gentipo. No Captulo II.2 apresenta-se uma viso mais abrangente dos efeitos da exposio a 185 M de Al em trigo, incluindo parmetros fisiolgicos, estruturais, citolgicos e genotxicos. Demonstra-se, pela primeira vez, que a progresso do ciclo celular diferentemente regulada, dependendo da tolerncia/sensibilidade do gentipo e que, mesmo em zonas j diferenciadas da raiz a exposio ao Al leva deposio de calose. O Captulo II.3 aborda os efeitos da exposio de 1.1 mM de Al em centeio, numa perspectiva bastante alargada. Apresenta-se o desequilbrio nutricional, sobretudo no gentipo sensvel, assim como a translocao de Al para a parte area nesse mesmo gentipo. Analisa-se tambm o comportamento de ambos os gentipos no que se refere ao ciclo celular, diferenciao da endoderme, crescimento radicular, reservas de hidratos de carbono, entre outros. Os resultados apontam para estratgias bem definidas adoptadas pelo gentipo tolerante de forma a minimizar a aco do Al no sistema radicular. O Captulo III compreende a exposio longa ao Al. Dois gentipos de centeio com diferentes graus de tolerncia ao Al foram expostos a 1.11 mM e 1.85 mM de Al durante 21 dias, tendo sido usados dois pontos de amostragem (15 e 21 dias). Este captulo est dividido em dois estudos: No Captulo III. 1 analisamse os mecanismos antioxidantes (folhas e razes) como resposta exposio ao Al, dando-se especial ateno ao ciclo do ascorbato-glutationas. A exposio ao Al levou a stress oxidativo e a alteraes na actividade de enzimas antioxidantes e no contedo de antioxidantes no-enzimticos. Demonstra-se que os dois rgos apresentam respostas diferentes exposio ao Al e que a capacidade de sobreviver em ambientes ricos em Al depende da eficcia da resposta antioxidante. Para alm disso, a resposta do ciclo ascorbato-glutationas parece estar dependente do tipo de rgo, grau de tolerncia e do tempo de exposio ao Al. No Captulo III. 2 analisam-se os efeitos da exposio ao Al na fotossntese. Verificou-se que o Al afecta negativamente a taxa fotossinttica em ambos os gentipos, embora as alteraes que o Al provoca nas trocas gasosas e no Ciclo de Calvin sejam dependentes do gentipo. Verificou-se tambm que os danos no gentipo sensvel surgem mais cedo do que no gentipo tolerante, mas que ambos apresentam susceptibilidade ao Al aps exposio de longo termo. Por fim, no Captulo IV so apresentadas as concluses da Tese de Doutoramento.
Resumo:
A toxicidade dos metais uma problemtica que envolve a sade humana e o ambiente, sendo necessria uma vigilncia constante e uma avaliao dos danos precisa e robusta. As plantas, como principal fonte alimentar e de produtos, so de vital importncia sociedade humana. Devido a serem seres sesseis, este grupo um dos mais afectados por poluentes, tornandoos objectos de estudo extremamente interessantes. O objectivo desta tese foi avaliar os efeitos genotxicos e citotxicos do Cr(VI) e Pb2+ na espcie modelo Pisum sativum L. No capitulo I introduzida a problemtica da toxicidade de ambos os metais, com especial relevo nas plantas, bem como as abordagens mais actuais no estudo da geno e citotoxicidade. No capitulo II so apresentados os resultados dos estudos da genotoxicidade do Pb2+ (II-1) e Cr(VI) (II-2 e II-3), tendo sido realizados analises de dano ao DNA a vrios nveis e alteraes do ciclo celular (II-1 e II-2), bem como a deteco de instabilidade de microssatelites (II-1 e II-3), que um indicador do estado funcional do mecanismo de reparao do DNA. O captulo III aborda o efeito de stresses abiticos na capacidade fotossinttica da espcie modelo. No captulo III-1, realizou-se um estudo pioneiro de avaliao da aplicabilidade da citometria de fluxo no estudo da fotossntese, mais concretamente no estado funcional e estrutural dos cloroplastos, quando expostos a um inibidor da fotossntese (Paraquat). Os dados obtidos neste estudo encorajaram a aplicao da tcnica nos captulos III-2 e III-3, nos quais se analisaram os efeitos dos metais Pb2+ (III- 2) e Cr(VI) (III-3) na capacidade fotossinttica de plantas expostas a este metal; em estudos que envolveram vrios marcadores clssicos, para alem dos da citometria de fluxo. Finalmente, no captulo IV so apresentadas as concluses finais do trabalho, uma comparativa entre os efeitos e nveis de toxicidade dos dois metais em estudo e so apontadas algumas perspectivas para futuros estudos, levantadas pelos dados obtidos.
Resumo:
The genetic code establishes the rules that govern gene translation into proteins. It was established more than 3.5 billion years ago and it is one of the most conserved features of life. Despite this, several alterations to the standard genetic code have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes, namely in the fungal CTG clade where a unique seryl transfer RNA (tRNACAG Ser) decodes leucine CUG codons as serine. This tRNACAG Ser appeared 27225 million years ago through insertion of an adenosine in the middle position of the anticodon of a tRNACGA Ser gene, which changed its anticodon from 5-CGA-3 to 5-CAG-3. This most dramatic genetic event restructured the proteome of the CTG clade species, but it is not yet clear how and why such deleterious genetic event was selected and became fixed in those fungal genomes. In this study we have attempted to shed new light on the evolution of this fungal genetic code alteration by reconstructing its evolutionary pathway in vivo in the yeast Saccharomyces cerevisiae. For this, we have expressed wild type and mutant versions of the C. albicans tRNACGA Ser gene into S. cerevisiae and evaluated the impact of the mutant tRNACGA Ser on fitness, tRNA stability, translation efficiency and aminoacylation kinetics. Our data demonstrate that these mutants are expressed and misincorporate Ser at CUGs, but their expression is repressed through an unknown molecular mechanism. We further demonstrate, using in vivo forced evolution methodologies, that the tRNACAG Ser can be easily inactivated through natural mutations that prevent its recognition by the seryl-tRNA synthetase. The overall data show that repression of expression of the mistranslating tRNACAG Ser played a critical role on the evolution of CUG reassignment from Leu to Ser. In order to better understand the evolution of natural genetic code alterations, we have also engineered partial reassignment of various codons in yeast. The data confirmed that genetic code ambiguity affects fitness, induces protein aggregation, interferes with the cell cycle and results in nuclear and morphologic alterations, genome instability and gene expression deregulation. Interestingly, it also generates phenotypic variability and phenotypes that confer growth advantages in certain environmental conditions. This study provides strong evidence for direct and critical roles of the environment on the evolution of genetic code alterations.
