Otimização da RT-PCR Multiplex para detecção de vírus dengue em amostras de Aedes aegypti infectados artificialmente

A dengue é a mais importante doença viral transmitida por mosquitos, no que diz respeito à morbidade e mortalidade, que afeta os seres humanos. Este vírus é transmitido pelos vetores Aedes albopictus e Aedes aegypti, este último é o principal vetor nas Américas. O controle da doença se baseia na vigilância laboratorial e vigilância entomológica. A vigilância laboratorial visa aprimorar a capacidade do diagnóstico, detectando precocemente a circulação viral e monitorando os sorotipos circulantes. Dentro deste tipo de vigilância, a RT-PCR é um método bastante usado no diagnóstico da doença em humanos e mosquitos, porém, a má conservação do material pode comprometer a integridade do RNA e trazer resultados falso-negativos. O desenvolvimento de melhores métodos de vigilância do vírus dengue (DENV) em mosquitos é de grande valor para os programas de controle. Desta maneira, o presente projeto visou otimizar a técnica de RT-PCR Multiplex para detecção de DENV em amostras de Ae. aegypti infectadas artificialmente pelo vírus. Primers que amplificam uma região de 80 pb do gene rpL8 de mosquito foram desenhados no site Primer3 e avaliados na ferramenta online Multiple Primer Analyzer, junto com primers que amplificam os sorotipos DENV. Não houve competição de primers e foi observado bandas distintas no gel de agarose. Foi avaliado o efeito de diferentes formas de preservação do material genético das amostras (RNAlater®, freezer -80°C e nitrogênio líquido) por 7 dias, onde não houve diferenças significativas em relação à integridade do RNA. O efeito de diferentes formas de extração de RNA (Kit da QIAGEN® , TRIzol® e Chomczymski-Sacchi) também foi avaliado e o método ChomczymskiSacchi obteve o melhor desempenho. A otimização desta técnica permitirá uma maior confiabilidade nos resultados, já que além da detecção dos sorotipos, haverá uma confirmação da qualidade do RNA, aprimorando a capacidade do diagnóstico e auxiliando a prevenção e controle da transmissão da dengue.

Avaliação dos conhecimentos e procedimentos em biossegurança de trabalhadores de laboratórios nível de biossegurança 3

A Biossegurança constitui um campo do conhecimento com limites amplos e em constante construção. Entretanto, no Brasil, sua evolução teve fraco acompanhamento, especialmente em relação aos conhecimentos e procedimentos dos profissionais e infraestrutura dos laboratórios nível de Biossegurança 3, com poucos dados que possam indicar o grau de desenvolvimento e aplicabilidade de suas normas nas diversas instituições de saúde. Contudo, não bastam a adequação e funcionabilidade da infraestrutura predial, mas sim o conhecimento das necessidades dos usuários no sentido de propiciar aceitação das normas de Biossegurança por meio da conscientização dos riscos levando à mudança na conduta e no comportamento. Para isto, torna-se imprescindível a elaboração de treinamentos teóricos e práticos com atualizações constantes dos profissionais da área de saúde que deverão ser avaliados periodicamente para que haja melhorias nos programas de treinamentos oferecidos, uma vez que esses programas visam a garantir a qualidade e a segurança dos profissionais, dos ambientes internos e externos, à população em geral e a qualidade dos resultados pretendidos. Neste contexto, este trabalho teve, como objetivo principal, avaliar, a partir da pesquisa descritiva com abordagem qualitativa e exploratória, os dados coletados por questionários e entrevistas estruturadas, aplicadas aos 37 profissionais e nove gestores dos seis laboratórios NB3 participantes. A análise dos dados foi feita pela abordagem da multirreferencialidade, considerando os conhecimentos e procedimentos em Biossegurança e os possíveis impactos das estratégias dos últimos treinamentos oferecidos a esses profissionais, assim como as condições das instalações laboratoriais no país Dentre as respostas obtidas, há constatações importantes: alguns profissionais relataram não ter recebido treinamento específico para o início dos trabalhos, demonstrando falta de organização e critérios, por parte das instituições e gestores, para o ingresso de novos trabalhadores em laboratórios NB3; não houve padronização de conceitos e percepções relacionados à Biossegurança dentre os profissionais avaliados; mais da metade dos laboratoristas, incluindo gestores, alegaram trabalhar sozinhos em ambientes nível 3; a maior parte dos profissionais relatou que os laboratórios foram bem construídos mas todos, incluindo usuários e gestores, afirmaram que gostariam que a situação atual fosse melhor. Em relação à gestão dos laboratórios, foram relatadas várias falhas, tais como falta ou não atualização de POP específico para o trabalho em NB3, ausência de documentos de notificação de acidentes, falta de acompanhamento dos profissionais destinados à limpeza do laboratório NB3, ausência de realização de exames clínicos, imunizações e armazenamento de soro base como controle. De acordo com as respostas apresentadas, observamos que nem todos os indivíduos, incluídos neste estudo, trabalham da maneira correta ou seguem uma metodologia de trabalho padronizada, deficiência relatada, inclusive, pela maioria dos próprios profissionais A realização dos cursos de Biossegurança e treinamentos somente não garantem preparo pleno dos profissionais para o exercício de suas obrigações em laboratórios NB3. Esta atividade e o monitoramento das instalações NB3 devem ser contínuos e de responsabilidade dos profissionais e das instituições, garantindo que as rotinas de trabalho estejam de acordo com as normas de Biossegurança