Otimização da RT-PCR Multiplex para detecção de vírus dengue em amostras de Aedes aegypti infectados artificialmente

A dengue é a mais importante doença viral transmitida por mosquitos, no que diz respeito à morbidade e mortalidade, que afeta os seres humanos. Este vírus é transmitido pelos vetores Aedes albopictus e Aedes aegypti, este último é o principal vetor nas Américas. O controle da doença se baseia na vigilância laboratorial e vigilância entomológica. A vigilância laboratorial visa aprimorar a capacidade do diagnóstico, detectando precocemente a circulação viral e monitorando os sorotipos circulantes. Dentro deste tipo de vigilância, a RT-PCR é um método bastante usado no diagnóstico da doença em humanos e mosquitos, porém, a má conservação do material pode comprometer a integridade do RNA e trazer resultados falso-negativos. O desenvolvimento de melhores métodos de vigilância do vírus dengue (DENV) em mosquitos é de grande valor para os programas de controle. Desta maneira, o presente projeto visou otimizar a técnica de RT-PCR Multiplex para detecção de DENV em amostras de Ae. aegypti infectadas artificialmente pelo vírus. Primers que amplificam uma região de 80 pb do gene rpL8 de mosquito foram desenhados no site Primer3 e avaliados na ferramenta online Multiple Primer Analyzer, junto com primers que amplificam os sorotipos DENV. Não houve competição de primers e foi observado bandas distintas no gel de agarose. Foi avaliado o efeito de diferentes formas de preservação do material genético das amostras (RNAlater®, freezer -80°C e nitrogênio líquido) por 7 dias, onde não houve diferenças significativas em relação à integridade do RNA. O efeito de diferentes formas de extração de RNA (Kit da QIAGEN® , TRIzol® e Chomczymski-Sacchi) também foi avaliado e o método ChomczymskiSacchi obteve o melhor desempenho. A otimização desta técnica permitirá uma maior confiabilidade nos resultados, já que além da detecção dos sorotipos, haverá uma confirmação da qualidade do RNA, aprimorando a capacidade do diagnóstico e auxiliando a prevenção e controle da transmissão da dengue.

Estudo clínico, laboratorial e epidemiológico da infecção por Toxoplasma gondii em animais silvestres, bovinos, suínos e comunidades rurais da região de Nhecolândia, Pantanal, Brasil

A toxoplasmose, causada pelo Toxoplasma gondii é uma protozoose que acomete o homem e uma grande variedade de animais de sangue quente e aves. No Brasil, a prevalência pode variar de 20% a 90% dependendo da área estudada, clima, condição socioeconômica e cultural. A infecção se dá através da ingestão de oocistos, que podem ser encontrados no solo, água e alimentos ou através da manipulação e ingestão de carne crua ou mal cozida, além da infecção congênita, apresentando importância em saúde pública. Este trabalho objetivou estudar a ocorrência da infecção por Toxoplasma gondii em animais silvestres, bovinos, suínos, ovinos e comunidade rural da região de Nhecolândia, no Pantanal do Mato Grosso do Sul, utilizando métodos sorológicos (Hemaglutinação Indireta - HAI, Reação de Imunofluorescência Indireta - RIFI, Técnica de aglutinação modificada - MAT) e moleculares (Reação em cadeia pela polimerase \2013 PCR, PCR-RFLP). Foram feitas coletas de amostras de sangue de 73 indivíduos da comunidade rural, de 25 cães, 442 bovinos e 148 porco-monteiros. Observou-se que 47,95% (35/73) das pessoas eram sororreagentes. Destas, apenas um indivíduo sororreagente (2,9%) apresentou lesão ocular presumível da infecção pelo parasito. Nos animais, observou-se a ocorrência de anticorpos anti- T. gondii em 48% dos cães, 30,55% dos bovinos e 1,3% nos porco-monteiros. Relatos de várias partes do mundo têm demonstrado a importância do ciclo silvestre na epidemiologia da infecção por Toxoplasma gondii. No entanto, apesar do papel conhecido de alguns felinos selvagens como hospedeiros definitivos para manutenção e transmissão do parasita para outros predadores carnívoros, pouco se sabe sobre a incidência de Toxoplasma gondii nestes animais Os carnívoros foram capturados em armadilhas contendo iscas e após a contenção química as amostras biológicas (sangue de todos os animais e fezes dos felídeos) foram coletadas e armazenadas para análise posterior. No presente estudo, três espécies de carnívoros foram avaliadas: quati (Nasua nasua), lobinho ou cachorro do mato (Cerdocyon thous) e jaguatirica (Leopardus pardalis). Quarenta e dois roedores (Tricomys) também avaliados tiveram análises de PCR realizada em 42 tecidos (cérebro, pulmão e músculo). Através dos exames sorológicos (Hemaglutinação Indireta, Reação de Imunofluorescência Indireta, Técnica de aglutinação modificada) observou-se a ocorrência da infecção por Toxoplasma gondii em 29,16% (7/24) dos quatis, 47,82% (11/23) em lobinhos e 100% (2/2) nas jaguatiricas. No PCR observou-se positividade em 41,66% (10/24) dos quatis, 47,82 % (11/23) dos lobinhos e em 100% (2/2) das jaguatiricas. Em roedores, observou-se 23,80 % (10/42) de positivos pela PCR. Realizamos a caracterização molecular de amostras sanguíneas dos animais silvestres positivos pela PCR, onde utilizamos 12 marcadores genotípicos (SAG1, SAG2 (5\2019-SAG2 e 3\2019-SAG2), SAG3, GRA6, BTUB, c22-8, c29-2, L358, PK1, novo SAG2, Apico, CS3), onde observou-se a presença de um novo genótipo do parasito, circulando na região de forma homogênea entre as espécies