Avaliação da α-glicosidase Cqm1 de Culex quinquefasciatus e o impacto de suas mutações na fisiologia de larvas

Lysinibacillus sphaericus (Lsp) é uma bactéria entomopatógena que produz a toxina Bináriav(Bin) com atividade larvicida para culicídeos. A sua ação em Culex quinquefasciatus depende da ligação da toxina Bin à α-glicosidase (Aglu) Cqm1, que atua como receptor no epitélio intestinal de larvas. Na colônia R2362, foram caracterizados dois alelos de resistência ao Lsp: cqm1REC e cqm1REC-2, cujas mutações impedem a expressão da Aglu Cqm1. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade catalítica da Cqm1 e comparar a atividade α-glicosidase e o desenvolvimento pré-imaginal de larvas de indivíduos susceptíveis (S) e resistentes (R) para cada alelo. Para isto, foram avaliados os seguintes parâmetros: atividade catalítica da Cqm1 recombinante; padrão de transcrição de outras Aglus parálogas à Cqm1; atividade de Aglus nativas em larvas; sobrevivência de indivíduos frente a diferentes dietas. A Aglu Cqm1 mostrou atividade enzimática ótima à 37o C, pH 7,5-8,0 e utilizando o substrato sintético pNαG. A atividade α-glicosidase total em larvas S e R foi similar, apesar da ausência de expressão da Cqm1 nas larvas R. A investigação in silico revelou 18 proteínas parálogas à Cqm1 e, dentre 11 investigadas, nove são expressas em larvas S e R. A análise quantitativa de três parálogas demonstrou que duas tem um padrão de transcrição mais elevado em larvas resistentes, sugerindo a existência de um mecanismo de compensação de expressão de α-glicosidases. O desenvolvimento pré-imaginal de larvas S foi decrescente nas seguintes dietas: ração de gatos, ração de peixes, leite desnatado, extrato de levedura e sacarose. De uma forma global, a taxa de sobrevivência de larvas R foi inferior à S em todas as dietas testadas. Os dados obtidos mostram que as mutações ligadas aos alelos cqm1REC e cqm1REC-2 não parecem impactar a atividade Aglu nas larvas e que o custo biológico observado poderia estar relacionado a outros genes e vias metabólicas.

Avaliação de duas técnicas de reação em cadeia da polimerase na detecção do Mycobacterium tuberculosis em diferentes amostras biológicas

A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis e que permanece como um importante problema de saúde pública mundial, sendo a TB pulmonar a forma mais comum de apresentação da doença. O diagnóstico precoce e tratamento adequado são essenciais para a eficácia dos programas públicos de controle da TB. Novos metodologias mais rápidas, sensíveis e específicas, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), vem sendo propostas no diagnóstico da doença. O objetivo desse estudo foi avaliar o desempenho de duas PCR, a PCR em tempo real (qPCR) e a Nested PCR em único tubo (STNPCR), em diferentes amostras biológicas, no diagnóstico da tuberculose pulmonar, além de compará-las com as metodologias convencionais (baciloscopia e cultura) e entre si. Para isso foram analisados 125 pacientes que tiveram amostras de sangue (125 amostras de plasma e 116 amostras de PBMC), urina (n=125) e escarro (n=125) coletadas, totalizando a análise de 491 amostras biológicas. Amostras de escarro e urina foram descontaminadas pelo método de Petroff NAOH 4 por cento modificado e semeadas em meio de cultura Lõwenstein-Jensen (LJ), enquanto as amostras de sangue eram separadas em plasma e PBMC. Após processamento, deu-se a extração de DNA através do kit comercial da Qiagen seguida de amplificação pelas duas metodologias de PCR. Para análise estatística calculou-se a sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo e índice kappa das técnicas. A STNPCR apresentou, em amostras de sangue, sensibilidade de 26,3 por cento e especificidade de 97,7 por cento. Em amostras de urina observou-se uma S = 7,9 por cento e E = 98,9 por cento e em escarro S = 21,1 por cento e E = 98,9 por cento. Quando analisadas as asmotras em paralelo, a sensibilidade da STNPCR foi igual a 44,7 por cento enquanto sua especificidade foi 97,7 por cento. Já a qPCR, em amostras de sangue, obteve sensibilidade igual a 26,3 por cento e especificidade de 95,4 por cento. Em amostras de urina a sensibilidade obtida foi 47,4 por cento e a especificidade 79,3 por cento e, em escarro, S = 36,8 por cento e E = 95,4 por cento. Quando analisada em paralelo, a sensibilidade da qPCR foi 65,8 por cento e a especificidade foi 79,3 por cento. A baciloscopia de escarro apresentou sensibilidade de 41,7 por cento e especificidade de 100 por cento, enquanto as culturas em urina e escarro apresentaram sensibilidade e especificidade, respectivamente, de 10,5 por cento e 100 por cento e 60,5 por cento e 96,6 por cento. Pode-se concluir que a qPCR apresentou melhor desempenho quando comparada à STNPCR e também bom desempenho quando comparada às metodologias convencionais, e que quando analisa-se mais de um tipo de amostras biológica, a eficácia das técnicas é aumentada. Espera-se que com a utilização dessa técnica molecular, seja possível a melhor elucidação dos casos de TB pulmonar, promovendo maior taxa de tratamento dos pacientes e menor risco de transmissão da doença