Estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na leishmaniose visceral

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. O trabalho teve como objetivo avaliar estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na LV, que compreenderam a avaliação da eficiência de diferentes métodos de extração de DNA em amostras de urina; a análise do uso da Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para a detecção do DNA de Leishmania infantum na referida amostra; e a padronização de uma reação duplex qPCR para a detecção simultânea do DNA de L. infantum e do gene G3PD (controle endógeno). Depois da escolha do protocolo de extração de DNA mais apropriado, e após a otimização e a análise de reprodutibilidade, uma qPCR em urina foi padronizada. Em paralelo, após o desenho e a síntese de sondas TaqMan® compatíveis com os sistemas LINF 1B e G3PD1, após otimização e análise de reprodutibilidade, uma duplex qPCR em sangue também foi padronizada. Para avaliação dos protocolos desenvolvidos foram utilizadas técnicas de estatística descritiva. Para análise comparativa com técnicas clássicas de diagnóstico da LV utilizou-se Teste Qui Quadrado de independência ou Teste Exato de Fisher (p<0,05 e p<0,01, respectivamente). Como resultados, após otimização, o limite de detecção alcançado pela qPCR em urina utilizando o protocolo de extração selecionado (kit comercial) foi de 5 fg/microlitros de amostra 0,034 parasitos) A duplex qPCR em sangue alcançou um limite de detecção de 2x102 fg/microlitros de amostra 1,4 (ou ~ 1,4 parasito), após a otimização. A partir dos dados estatísticos obtidos, pôde-se analisar alta concordância percentual entre a qPCR e urina e o conjunto de critérios diagnósticos (sorologia rK39 + qPCR em sangue), bem como entre a duplex qPCR em sangue e a qPCR em sangue, para os Grupos 01 (pacientes com suspeita de LV) e 02 (pacientes HIV positivos co-infectados ou não). Como um conjunto de critérios, os dois novos ensaios obtiveram excelentes concordâncias com o conjunto de técnicas clássicas: 88,89 por cento e 94,74 por cento para os Grupos 01 e 02, respectivamente. Não houve diferenças estatísticas significativas entre os testes. Pôde-se concluir que ambos os ensaios mostraram bom potencial para a incorporação, após validação, ao diagnóstico da LV; em conjunto ou individualmente (quando necessário), trazendo mais conforto, praticidade, confiabilidade e rapidez ao diagnóstico definitivo da patologia

Confecção e ampliação do painel sorológico de HTLV

A verificação da qualidade dos kits de diagnóstico para detecção do HTLV-I/II é essencial, uma vez que são utilizados tanto em rotinas laboratoriais como em Serviços de Hemoterapia para aprovar a doação de sangue. Os conjuntos diagnósticos constituem uma ferramenta fundamental para diagnóstico por possuírem uma alta sensibilidade e especificidade, garantindo a confiabilidade dos resultados. Pela variedade de conjuntos diagnósticos encontrados no mercado, é necessário um rigoroso controle de qualidade para evitar possíveis erros analíticos como resultados falso-positivos, causando problemas emocionais e sociais no doador. O presente trabalho foi realizado no intuito de caracterizar unidades de plasma obtidas de Serviços de Hemoterapia de diversas regiões do país para compor e ampliar um painel de referência para HTLV que será utilizado na verificação do controle de qualidade dos kits de diagnóstico para o HTLV-I/II, aumentando a capacidade analítica do Laboratório de Sangue e Hemoderivados (LSH), localizado no Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS)/Fiocruz. Desta forma, foram analisadas no período de 2000 a 2013, 3.559 unidades de plasma. Das unidades que foram encaminhadas para o INCQS, 109 foram enviadas como reagentes para HTLV, sendo recaracterizadas pela triagem de marcadores para HIV-1/2, hepatite C, HBsAg, anti-HBc, Doença de Chagas e Sífilis. A princípio foram realizados dois testes para HTLV-I/II. As unidades de plasma com reatividade apenas para anti-HTLV-I/II foram testadas através da técnica de ELISA e nas amostras com resultado reativo, a confirmação foi realizada por Western Blot. Todos os testes realizados seguiram rigorosamente as técnicas descritas nos manuais de instrução de cada fabricante. Por fim, foram obtidas76 amostras com reatividade para anti-HTLV-I/II, possibilitando a ampliação do painel de referência já existente no LSH e consequentemente a capacidade analítica do laboratório.