Estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na leishmaniose visceral

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. O trabalho teve como objetivo avaliar estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na LV, que compreenderam a avaliação da eficiência de diferentes métodos de extração de DNA em amostras de urina; a análise do uso da Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para a detecção do DNA de Leishmania infantum na referida amostra; e a padronização de uma reação duplex qPCR para a detecção simultânea do DNA de L. infantum e do gene G3PD (controle endógeno). Depois da escolha do protocolo de extração de DNA mais apropriado, e após a otimização e a análise de reprodutibilidade, uma qPCR em urina foi padronizada. Em paralelo, após o desenho e a síntese de sondas TaqMan® compatíveis com os sistemas LINF 1B e G3PD1, após otimização e análise de reprodutibilidade, uma duplex qPCR em sangue também foi padronizada. Para avaliação dos protocolos desenvolvidos foram utilizadas técnicas de estatística descritiva. Para análise comparativa com técnicas clássicas de diagnóstico da LV utilizou-se Teste Qui Quadrado de independência ou Teste Exato de Fisher (p<0,05 e p<0,01, respectivamente). Como resultados, após otimização, o limite de detecção alcançado pela qPCR em urina utilizando o protocolo de extração selecionado (kit comercial) foi de 5 fg/microlitros de amostra 0,034 parasitos) A duplex qPCR em sangue alcançou um limite de detecção de 2x102 fg/microlitros de amostra 1,4 (ou ~ 1,4 parasito), após a otimização. A partir dos dados estatísticos obtidos, pôde-se analisar alta concordância percentual entre a qPCR e urina e o conjunto de critérios diagnósticos (sorologia rK39 + qPCR em sangue), bem como entre a duplex qPCR em sangue e a qPCR em sangue, para os Grupos 01 (pacientes com suspeita de LV) e 02 (pacientes HIV positivos co-infectados ou não). Como um conjunto de critérios, os dois novos ensaios obtiveram excelentes concordâncias com o conjunto de técnicas clássicas: 88,89 por cento e 94,74 por cento para os Grupos 01 e 02, respectivamente. Não houve diferenças estatísticas significativas entre os testes. Pôde-se concluir que ambos os ensaios mostraram bom potencial para a incorporação, após validação, ao diagnóstico da LV; em conjunto ou individualmente (quando necessário), trazendo mais conforto, praticidade, confiabilidade e rapidez ao diagnóstico definitivo da patologia

Diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana utilizando a saliva coletada com swab

As leishmanioses caracterizam-se por um espectro de doenças distribuídas endemicamente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. A obtenção de material biológico para análise diagnóstica apresenta cuidados cruciais ao paciente, por se tratar de um processo invasivo, passível de inflamação, e podendo haver reativação da doença, em alguns casos. Diante do avanço das técnicas moleculares e da utilização de alguns fluidos biológicos para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), cogitou-se a possibilidade da identificação de DNA de Leishmania spp. em saliva através do método de coleta de swab, sendo contribuinte para o avanço no diagnóstico laboratorial. Assim, o propósito do estudo foi a identificação de DNA de Leishmania spp. a partir do diagnóstico molecular. Foram incluídos no estudo os pacientes que apresentaram lesões ativas, diagnósticos clínicos para LTA, antecedentes epidemiológicos compatíveis e não possuíam lesões cutâneo mucosas. O diagnóstico laboratorial envolveu a abordagem parasitológica através da pesquisa direta do parasito em amostras escarificadas de lesões, enquanto que o molecular compreendeu a extração do DNA das amostras de biópsia e swab salivar, seguidas da reação de PCR convencional (cPCR) e PCR em tempo real (qPCR). Foram investigados 40 pacientes com LTA havendo ocorrência de DNA do parasito em 10 amostras de saliva com cPCR, e 36 amostras utilizando qPCR. Em 28 amostras de biópsias também foi possível a detecção do DNA de Leishmania spp. e em 35 amostras de escarificado de lesão foram encontradas formas amastigotas do parasito, através de pesquisa direta. Na comparação entre os métodos propostos, a biópsia apresentou uma média de 50 por cento de compatibilidade em relação a cPCR e 67,5 por cento para a qPCR. A análise comparativa observou entre o diagnóstico parasitológico e os diagnósticos moleculares uma concordância de 32,5 por cento (14/40) em relação a cPCR, enquanto que a qPCR obteve 75,5 por cento (31/40) de concordância. Considerando a sensibilidade das técnicas de PCR utilizadas e o procedimento de coleta, através de swab advindo de fluidos salivares, os resultados demonstram a viabilidade do método de coleta de Leishmania spp. como uma nova abordagem diagnóstica auxiliar para a LTA, com benefícios à saúde do paciente

Estudo clínico-molecular na Leishmaniose mucocutânea diagnóstico e rastreamento de subpopulações de Leishmania (Viannia) braziliensis nos níveis inter e intrapacientes

O presente estudo teve como principal objetivo avaliar a diversidade genética de Leishmania (Viannia) braziliensis nos níveis inter e intrapacientes, diretamente em lesões cutâneas e mucosas de indivíduos com leishmanioses mucocutânea (LMC), disseminada (LD) e mucosa (LM), incluindo indivíduos coinfectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Um total de 61 amostras procedentes de 38 pacientes foi analisado pelas técnicas da reação em cadeia da polimerase (PCR), da reação em cadeia da polimerase com primer único em condições de baixa estringência (LSSP-PCR) e da análise fenética, tendo como alvo molecular a região variável do minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA). Neste estudo, predominaram indivíduos do sexo masculino e com acometimento mucoso nasal. A presença de DNA do parasita foi evidenciada pela banda diagnóstica de 750 pb, em todas as amostras analisadas, possibilitando o diagnóstico específico. Na investigação do perfil genotípico de subpopulações de L. (V.) braziliensis, através da LSSP-PCR, foi revelado o polimorfismo genético intrafragmento traduzido como uma assinatura do kDNA do parasito para cada amostra. Assinaturas de kDNAs similares em amostras de paciente coletadas ao mesmo tempo (mucosa oral e nasal), e a divergência nos perfis genéticos em amostras coletadas em tempos diferentes na mesma localização (mucosa nasal) sugerem a clonalidade do inóculo inicial, como consequência da estrutura populacional clonal de Leishmania No estudo da variabilidade genética de L. (V.) braziliensis nos níveis inter e intrapacientes foram evidenciadas similaridades genotípicas entre as amostras de lesões cutânea e mucosa intrapacientes. As análises fenética e estatística possibilitaram afirmar que a diversidade genética no nível intrapacientes é menor do que a observada entre os pacientes. Nenhuma associação pode ser observada entre os perfis genéticos de L. (V.) braziliensis e as formas clínicas da doença (LM, LMC, LD), e nem em relação à localização da lesão cutânea ou mucosa (nasal ou oral). O polimorfismo genético de L. (V.) braziliensis também foi evidenciado nos pacientes coinfectados pelo HIV, cuja análise fenética reuniu os perfis genéticos em dois grupos distintos, os quais discriminaram entre as amostras obtidas de pacientes com coinfecção Leishmania/ HIV daquelas obtidas de pacientes não coinfectados. A discriminação de perfis genéticos diferenciados de L. (V.) braziliensis em pacientes coinfectados pelo HIV sugere que a imunossupressão tem impacto na estrutura populacional do parasita. Os nossos resultados corroboram a complexidade genética existente nos parasitos do gênero Leishmania, reforçando a diversidade na dinâmica populacional e na plasticidade genética de L. (V.) braziliensis