Avaliação das quimiocinas e da expressão de seus receptores em células mononucleares de pacientes portadores da doença de Chagas submetidas à infecção in vitro com Trypanosoma cruzi e tratamento com benzonidazol

Atualmente o Brasil apresenta 3 milhões de indivíduos portadores da cardiomiopatia chagásica. Porém, tratamento etiológico com o fármaco Benzonidazol (BZ) na fase crônica da doença ainda não está elucidado. Acredita-se que a recomendação do BZ nessa fase, pode prevenir ou retardar a evolução clínica da cardiomiopatia na Doença Chagas (DC). Assim o objetivo do estudo é avaliar a produção de quimiocinas e expressão de seus receptores em Células mononucleares do sangue periférico - PBMC (de portadores crônicos da doença de Chagas) submetidas in vitro ao tratamento com BZ, após a infecção com T.cruzi. Foram selecionados 11 pacientes na fase crônica da doença. Amostras de sangue desses pacientes foram coletadas para obtenção de PBMC, em que foram cultivadas em placas de cultivo na concentração de 106 células/ml por poço. Após a adesão das células aderentes (principalmente macrófagos), as células não aderentes (principalmente linfócitos) foram removidas e as formas tripomastigotas foram adicionadas ao cultivo para infecção das células aderentes. Subsequente a incubação, as células não aderentes foram adicionadas novamente ao cultivo juntamente com o fármaco Bz (1µg/mL), ficando um co-cultivo de células aderentes infectadas com T.cruzi, células não aderentes e o BZ (C+T+BZ). As placas de cultura foram incubadas por períodos de 24h e 5 dias. Para uma análise fidedigna da ação do BZ nas células aderentes e não aderentes foi necessário a criação dos controles: células (C), células e tripomastigotas (C+T) e células e o BZ (C+BZ). Após o cultivo, foram coletados os sobrenadantes das culturas, para avaliação da produção de quimiocinas (CCL2, CXL9, CXL10, CCL5 e CXCL8) por CBA (Cytometric Bead Array). Posteriormente foi realizada a imunofenotipagem, avaliando a expressão dos receptores CCR3, CCR4, CXCR3, CXCR5, CCR1, CXCR4, CXCR2 e CCR5, em linfócitos T CD3+ e monócitos CD14+. Os resultados obtidos na avaliação dos linfócitos mostraram que o receptor CXCR5 esteve aumentado na condição C+T+BZ; e os receptores CCR4 e CCR1 estavam diminuídos nessa mesma condição. Nos monócitos observamos uma diminuição de CCR4 e um aumento do CCR5 nas mesmas condições. Com relação a dosagem de quimiocinas no sobrenadante, foi evidenciado que CCL2 e CXCL8 apresentaram uma diminuição na condição C+T+BZ. Assim podemos concluir que devido ao caráter inflamatório modulado, que o BZ conduziu, podemos afirmar que o fármaco demonstrou benefícios relevantes na expressão de receptores e na produção de quimiocinas

Implementação da tecnologia de IgY para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina

Os métodos de diagnóstico sorológico são ainda as ferramentas mais realistas e aplicáveis para identificação de cães com leishmaniose visceral. A pesquisa por métodos sorológicos mais eficientes e de produção simplificada é importante para a identificação do reservatório canino, ação primordial para o controle da doença. Este estudo teve por objetivo o desenvolvimento e a avaliação do desempenho de um ELISA para leishmaniose visceral canina, utilizando como conjugado enzimático uma IgY anti-IgG canina. Para isto, galinhas poedeiras foram imunizadas com IgG canina purificada e a IgY anti-IgG foi isolada das gemas dos ovos por precipitação com polietilenoglicol e purificada por meio de adsorção tiofílica. A especificidade frente ao antígeno imunizante foi verificada por imunodifusão radial dupla, ELISA e western-blot. O ELISA foi desenvolvido utilizando IgY conjugada a enzima peroxidase, tendo seus parâmetros de acurácia avaliados e comparados com o ELISA utilizando IgG de mamíferos conjugada a peroxidase. A concentração total de IgY isolada nas gemas foi constante, sem diferença significativa nos meses analisados (...), com média de 97,55 mg de IgY/ gema. A IgY produzida reconheceu a IgG canina, demonstrando uma forte sensibilidade e especificidade no ELISA, porém na imunodifusão não foi detectada ligação da IgY produzida a IgG canina. Após a imunização, houve um aumento significante da produção de IgY específica do primeiro para o segundo mês (...) onde ocorreu um pico estável sem queda de produção até o final do período analisado (...). A IgY demonstrou ainda, forte reatividade no western-Blot frente a IgG canina purificada e a presente no soro de cão clinicamente saudável, não sendo capaz de reconhecer IgG de outras espécies animais.