Caracterização de interações entre subunidades do complexo de iniciação da tradução EIF4F e homólogos da proteína de ligação ao poli-A (PABP) de Leishmania sp

Os tripanossomatídeos são caracterizados por processos moleculares diferenciados como a transcrição policistrônica e regulação pós-transcricional da expressão gênica. Em mamíferos, a tradução se inicia com a ligação do complexo eIF4F (formado pelos eIF4A, eIF4E e eIF4G) a extremidade 5' dos mRNAs, o que facilita seu reconhecimento pelo ribossomo. A atividade do eIF4F é reforçada pela proteína de ligação a cauda poli-A (PABP), na extremidade 3' dos mRNAs, que interage com o eIF4G. Dois complexos do tipo eIF4F foram identificados em tripanossomatídeos: o primeiro formado pelos EIF4G3, EIF4E4 e EIF4AI com a PABP1; e um outro baseado na interação do EIF4G4 com o EIF4E3 e o EIF4A1. Este trabalho buscou caracterizar as interações entre as subunidades destes complexos e sua associação com PABPs de Leishmania, avaliando o efeito de mutações em motivos específicos. Proteínas recombinantes foram geradas fusionadas a GST e avaliadas quanto a sua habilidade de interagir com parceiros marcados radioativamente em ensaios do tipo pull-down. Para o EIF4G3, mutações individuais em dois resíduos vizinhos (I8A e R9A), afetaram a interação com o EIF4E4 e a mutação de ambos os resíduos equivalentes do EIF4G4 (IL25-26AA) também impediu sua ligação ao EIF4E3, sugerindo um motivo comum para a ligação aos seus parceiros. As proteínas EIF4E3 e EIF4E4 foram avaliadas quanto à capacidade de interagir com a PABP2 e PABP1 respectivamente, e mutações em motivos conservados nas regiões N-terminais dos EIF4E (Boxes A, B e C) aboliram sua interação com os homólogos da PABP. Para identificar que regiões da PABP1 estão relacionadas às interações com o parceiro EIF4E4, foram obtidas proteínas PABP1 mutantes em motivos conservados e observou-se que a mutação no motivo TGM, C-terminal, aboliu sua interação com o EIF4E4. Com estas abordagens conseguiu-se avançar na definição das interações entre as referidas subunidades do eIF4F e PABP, identificando-se diferenças relevantes em relação a outros eucariotos

Implementação da tecnologia de IgY para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina

Os métodos de diagnóstico sorológico são ainda as ferramentas mais realistas e aplicáveis para identificação de cães com leishmaniose visceral. A pesquisa por métodos sorológicos mais eficientes e de produção simplificada é importante para a identificação do reservatório canino, ação primordial para o controle da doença. Este estudo teve por objetivo o desenvolvimento e a avaliação do desempenho de um ELISA para leishmaniose visceral canina, utilizando como conjugado enzimático uma IgY anti-IgG canina. Para isto, galinhas poedeiras foram imunizadas com IgG canina purificada e a IgY anti-IgG foi isolada das gemas dos ovos por precipitação com polietilenoglicol e purificada por meio de adsorção tiofílica. A especificidade frente ao antígeno imunizante foi verificada por imunodifusão radial dupla, ELISA e western-blot. O ELISA foi desenvolvido utilizando IgY conjugada a enzima peroxidase, tendo seus parâmetros de acurácia avaliados e comparados com o ELISA utilizando IgG de mamíferos conjugada a peroxidase. A concentração total de IgY isolada nas gemas foi constante, sem diferença significativa nos meses analisados (...), com média de 97,55 mg de IgY/ gema. A IgY produzida reconheceu a IgG canina, demonstrando uma forte sensibilidade e especificidade no ELISA, porém na imunodifusão não foi detectada ligação da IgY produzida a IgG canina. Após a imunização, houve um aumento significante da produção de IgY específica do primeiro para o segundo mês (...) onde ocorreu um pico estável sem queda de produção até o final do período analisado (...). A IgY demonstrou ainda, forte reatividade no western-Blot frente a IgG canina purificada e a presente no soro de cão clinicamente saudável, não sendo capaz de reconhecer IgG de outras espécies animais.