4 resultados para Guariglia, Osvaldo N.
em ARCA - Repositório Institucional da FIOCRUZ
Resumo:
Os tripanossomatÃdeos são caracterizados por processos moleculares diferenciados como a transcrição policistrônica e regulação pós-transcricional da expressão gênica. Em mamÃferos, a tradução se inicia com a ligação do complexo eIF4F (formado pelos eIF4A, eIF4E e eIF4G) a extremidade 5' dos mRNAs, o que facilita seu reconhecimento pelo ribossomo. A atividade do eIF4F é reforçada pela proteÃna de ligação a cauda poli-A (PABP), na extremidade 3' dos mRNAs, que interage com o eIF4G. Dois complexos do tipo eIF4F foram identificados em tripanossomatÃdeos: o primeiro formado pelos EIF4G3, EIF4E4 e EIF4AI com a PABP1; e um outro baseado na interação do EIF4G4 com o EIF4E3 e o EIF4A1. Este trabalho buscou caracterizar as interações entre as subunidades destes complexos e sua associação com PABPs de Leishmania, avaliando o efeito de mutações em motivos especÃficos. ProteÃnas recombinantes foram geradas fusionadas a GST e avaliadas quanto a sua habilidade de interagir com parceiros marcados radioativamente em ensaios do tipo pull-down. Para o EIF4G3, mutações individuais em dois resÃduos vizinhos (I8A e R9A), afetaram a interação com o EIF4E4 e a mutação de ambos os resÃduos equivalentes do EIF4G4 (IL25-26AA) também impediu sua ligação ao EIF4E3, sugerindo um motivo comum para a ligação aos seus parceiros. As proteÃnas EIF4E3 e EIF4E4 foram avaliadas quanto à capacidade de interagir com a PABP2 e PABP1 respectivamente, e mutações em motivos conservados nas regiões N-terminais dos EIF4E (Boxes A, B e C) aboliram sua interação com os homólogos da PABP. Para identificar que regiões da PABP1 estão relacionadas à s interações com o parceiro EIF4E4, foram obtidas proteÃnas PABP1 mutantes em motivos conservados e observou-se que a mutação no motivo TGM, C-terminal, aboliu sua interação com o EIF4E4. Com estas abordagens conseguiu-se avançar na definição das interações entre as referidas subunidades do eIF4F e PABP, identificando-se diferenças relevantes em relação a outros eucariotos
Resumo:
Os tripanossomatÃdeos são organismos caracterizados pelo controle póstranscricional da expressão gênica, principalmente em nÃvel de tradução. Na tradução em eucariotos, tem grande destaque o complexo eIF4F, sendo um de seus principais componentes o fator de iniciação da tradução eIF4E. Já foram descritos em tripanossomatÃdeos seis homólogos para o eIF4E, nomeados EIF4E1 a 6. Em um estudo com Leishmania amazonensis, focado no EIF4E3, percebeu-se que seu perfil de expressão se alterava rapidamente numa curva de crescimento, com este apresentando ao menos duas bandas. As mudanças observadas sugeriam modificações pós-traducionais do tipo fosforilação, algo posteriormente confirmado. Analisando-se a sequência do EIF4E3 de Leishmania, foi possÃvel identificar a presença de possÃveis sÃtios de fosforilação e de ligação a parceiros funcionais como homólogos do eIF4G, outro componente do complexo eIF4F, e da proteÃna de ligação á cauda poli-A (PABP). No presente estudo foi analisado o perfil de expressão e a capacidade de ligação a parceiros funcionais do EIF4E3 de Leishmania superexpresso em células transfectadas e no qual foram introduzidas mutações em motivos especÃficos. Os resultados mostraram um perfil de expressão de ao menos três bandas para o EIF4E3 de L. amazonensis e duas para L. infantum, com o sÃtio S75, presente apenas na primeira, sendo o responsável por esta diferença. Em ensaios de imunoprecipitação, foi identificado um motivo que, quando mutado, aboliu a ligação do EIF4E3 com a PABP3, sugerindo este como o sÃtio de interação entre os fatores. Com a análise do efeito de mutações no EIF4E3 de L. amazonensis, foi percebido que ao se mutar três motivos implicados na à PABP e o possÃvel sÃtio de ligação ao EIF4G, sua fosforilação diminuiu drasticamente, sugerindo a necessidade destas interações para que a fosforilação ocorra. Estes resultados indicam um complexo mecanismo de modificações pós-traducionais responsáveis pela regulação do EIF4E3 e contribuem a para a caracterização da sua função em Leishmania
Resumo:
Os tripanossomatÃdeos possuem uma combinação não usual de mecanismos moleculares, e seus processos de regulação de expressão gênica ocorreram a nÃvel pós-transcricional. Acredita-se que essa regulação envolva tanto o controle da estabilidade dos mRNAs, como sua tradução em proteÃnas, eventos em que atua a proteÃna de ligação à cauda poli-A (PABP - Poly-A Binding Protein), uma das principais proteÃnas de ligação a RNAs em eucariotos. Um grande número destas proteÃnas está presente nos tripanosomatÃdeos, se caracterizando por possuÃrem domÃnios tÃpicos de ligação a RNA, como o domÃnio RRM (RNA Recognition Motif). Dentre estas se destacam as proteÃnas de ligação a sequências ricas em uridina (UBPs), que se mostraram capazes de interagir com homólogos de PABP. Outras proteÃnas hipotéticas contendo domÃnios de ligação a RNA foram identificadas em ensaios que buscavam parceiros diferenciais para os três homólogos de PABP de Leishmania. Este trabalho se propôs a contribuir na caracterização funcional das proteÃnas UBPs e das proteÃnas hipotéticas, através da otimização de sua expressão de forma heteróloga em L. infantum, fusionadas ao epÃtopo HA. Para isto, os genes codificantes dos três homólogos de UBPs, e de cinco outras proteÃnas de ligação a RNA que parecem interagir com PABPs, foram amplificados e clonados em vetor de expressão de Leishmania. As construções geradas foram transfectadas em L. infantum e a expressão de seis destas proteÃnas avaliada. Os resultados obtidos mostram uma variação no reconhecimento das proteÃnas geradas com anticorpos comerciais anti-HA, que parecem depender da sequência de aminoácidos da sua extremidade C-terminal. Diferenças significativas nos seus nÃveis de expressão também foram observadas. Entre os três homólogos de UBP, dois destes se mostraram mais abundantes enquanto que os três são representados por mais de uma banda, indicando possÃveis modificações pós-traducionais
Resumo:
O lúpus eritematoso sistêmico juvenil (LESJ) é uma doença inflamatória crônica causada pela produção de autoanticorpos, que reconhecem como estranhos antÃgenos próprios do organismo, e possuem alta morbidade e mortalidade em relação à doença no adulto. Em sua patogênese estão envolvidos fatores ambientais, hormonais, imunológicos e genéticos. Estudos de associação genética demonstraram que a susceptibilidade ao lúpus é poligênica, e entre os genes envolvidos está o HLA-G que é responsável pela regulação da resposta imune. No estudo, foi analisada a expressão de isoforma da molécula HLA-G e observamos o perfil de resposta imune em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico juvenil. Os pacientes que participaram do estudo foram selecionados no serviço de Reumatologia do Hospital das ClÃnicas e foi coletado sangue periférico de 10 pacientes no momento ativo e inativo do LESJ. O estudo comparou a expressão do mRNA do HLA-G5, IL-10 e TNF, os nÃveis plasmáticos de sHLA-G e citocinas Th1, Th2 e Th17 entre os grupos com a doença ativa, inativa e o grupo de crianças saudáveis aplicando os testes de Mann-Whitney U e Kruskal-Wallis. Os resultados mostraram que pacientes com LESJ ativo apresentaram nÃveis elevados das citocinas IL-10 (p=0,004) e IL-6 (p=0,011), além de apresentarem expressão de mRNA do TNF mais elevada em relação ao grupo inativo (p0,05). Mesmo com número reduzido, foi possÃvel caracterizar que houve mudança do perfil de citocinas durante a ativação do LESJ, e a relação dessa ativação com a expressão de HLA-G solúvel, além de servir como base para proposta de um modelo de regulação imunológica, que poderá ser validado em futuros experimentos