Caracterização de interações entre subunidades do complexo de iniciação da tradução EIF4F e homólogos da proteína de ligação ao poli-A (PABP) de Leishmania sp

Os tripanossomatídeos são caracterizados por processos moleculares diferenciados como a transcrição policistrônica e regulação pós-transcricional da expressão gênica. Em mamíferos, a tradução se inicia com a ligação do complexo eIF4F (formado pelos eIF4A, eIF4E e eIF4G) a extremidade 5' dos mRNAs, o que facilita seu reconhecimento pelo ribossomo. A atividade do eIF4F é reforçada pela proteína de ligação a cauda poli-A (PABP), na extremidade 3' dos mRNAs, que interage com o eIF4G. Dois complexos do tipo eIF4F foram identificados em tripanossomatídeos: o primeiro formado pelos EIF4G3, EIF4E4 e EIF4AI com a PABP1; e um outro baseado na interação do EIF4G4 com o EIF4E3 e o EIF4A1. Este trabalho buscou caracterizar as interações entre as subunidades destes complexos e sua associação com PABPs de Leishmania, avaliando o efeito de mutações em motivos específicos. Proteínas recombinantes foram geradas fusionadas a GST e avaliadas quanto a sua habilidade de interagir com parceiros marcados radioativamente em ensaios do tipo pull-down. Para o EIF4G3, mutações individuais em dois resíduos vizinhos (I8A e R9A), afetaram a interação com o EIF4E4 e a mutação de ambos os resíduos equivalentes do EIF4G4 (IL25-26AA) também impediu sua ligação ao EIF4E3, sugerindo um motivo comum para a ligação aos seus parceiros. As proteínas EIF4E3 e EIF4E4 foram avaliadas quanto à capacidade de interagir com a PABP2 e PABP1 respectivamente, e mutações em motivos conservados nas regiões N-terminais dos EIF4E (Boxes A, B e C) aboliram sua interação com os homólogos da PABP. Para identificar que regiões da PABP1 estão relacionadas às interações com o parceiro EIF4E4, foram obtidas proteínas PABP1 mutantes em motivos conservados e observou-se que a mutação no motivo TGM, C-terminal, aboliu sua interação com o EIF4E4. Com estas abordagens conseguiu-se avançar na definição das interações entre as referidas subunidades do eIF4F e PABP, identificando-se diferenças relevantes em relação a outros eucariotos

Identificação de motivos relevantes para a função do fator de iniciação da tradução EIF4E3 de Leishmania sp

Os tripanossomatídeos são organismos caracterizados pelo controle póstranscricional da expressão gênica, principalmente em nível de tradução. Na tradução em eucariotos, tem grande destaque o complexo eIF4F, sendo um de seus principais componentes o fator de iniciação da tradução eIF4E. Já foram descritos em tripanossomatídeos seis homólogos para o eIF4E, nomeados EIF4E1 a 6. Em um estudo com Leishmania amazonensis, focado no EIF4E3, percebeu-se que seu perfil de expressão se alterava rapidamente numa curva de crescimento, com este apresentando ao menos duas bandas. As mudanças observadas sugeriam modificações pós-traducionais do tipo fosforilação, algo posteriormente confirmado. Analisando-se a sequência do EIF4E3 de Leishmania, foi possível identificar a presença de possíveis sítios de fosforilação e de ligação a parceiros funcionais como homólogos do eIF4G, outro componente do complexo eIF4F, e da proteína de ligação á cauda poli-A (PABP). No presente estudo foi analisado o perfil de expressão e a capacidade de ligação a parceiros funcionais do EIF4E3 de Leishmania superexpresso em células transfectadas e no qual foram introduzidas mutações em motivos específicos. Os resultados mostraram um perfil de expressão de ao menos três bandas para o EIF4E3 de L. amazonensis e duas para L. infantum, com o sítio S75, presente apenas na primeira, sendo o responsável por esta diferença. Em ensaios de imunoprecipitação, foi identificado um motivo que, quando mutado, aboliu a ligação do EIF4E3 com a PABP3, sugerindo este como o sítio de interação entre os fatores. Com a análise do efeito de mutações no EIF4E3 de L. amazonensis, foi percebido que ao se mutar três motivos implicados na à PABP e o possível sítio de ligação ao EIF4G, sua fosforilação diminuiu drasticamente, sugerindo a necessidade destas interações para que a fosforilação ocorra. Estes resultados indicam um complexo mecanismo de modificações pós-traducionais responsáveis pela regulação do EIF4E3 e contribuem a para a caracterização da sua função em Leishmania

Suscetibilidade in vitro e resistência a antifúngicosestudo comparativo entre os tipos moleculares VNI de Cryptococcus neoformans e VGI, VGII de Cryptococcus gattii pela citometria de fluxo

A criptococose é uma micose sistêmica adquirida pela inalação de basidiosporos ou leveduras desidratadas de Cryptococus neoformans e Cryptococus gattii, estas duas espécies podem causar criptococose oportunista e primária respectivamente. C. neoformans está constituído de tipos moleculares VNI-VNIV e C. gattii de VGI-VGIV que apresentam distribuição geográfica diferenciada, como por exemplo, o tipo VNI é cosmopolita e está associado a AIDS e VGI predominando na Austrália e EUA, o tipo VGII predominando no Brasil e America Latina. Este trabalho tem por objetivo realizar estudo comparado dos tipos moleculares VNI de C. neoformans, VGI e VGII de C. gattii analisando diferentes aspectos tais como: 1- Determinar o perfil da suscetibilidade in vitro da concentração inibitória mínima (CIM) de fluconazol (FLZ), itraconazol (ITZ), 5-fluorocitosina (5FC) e anfotericina B (AMB), isoladamente e de forma combinada de AMB com 5FC e AMB com Voriconazol (VRZ); 2- Determinar CIM pela citometria de fluxo (CMF) frente a FLZ, ITZ e AMB; 3- Definir a concentração mínima letal (CML) de AMB e 5FC, isoladamente e em combinação; 4- Avaliar a ação da melanina frente a 5FC e AMB na forma combinada e isolada de 5FC; 5- Induzir a resistência in vitro para FLZ e padronizar os fluorocromos: acetoximetil - calceína (calceina-AM), acetoximetil - 2\2019, 7\2019 -bis-(2-carboxietil)-5-(e -6)- carboxifluoresceína (BCECF-AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3\2019 \2013dipentiloxacarbocianina (DiOC5) na CMF para verificar a expressão de bombas de efluxo; 6- Comparar a expressão de bombas de efluxo Os resultados permitiram identificar diferentes fenótipos de suscetibilidade que foram analisados e comparados entre as duas espécies e os tipos moleculares, permitindo a produção de quatro artigos; sendo assim, concluímos que: 1- Na análise das CIMs o tipo molecular VGII apresentou-se menos suscetível em relação a VGI e VNI; já na combinação in vitro de AMB e VRZ foi observado 100% de indiferença, e na combinação de AMB e 5FC observou-se necessidade de padronização da concentração da glicose para obter testes que possam ser futuramente relacionados a casos clínicos; 2- O método de CMF demonstrou ser alternativa de leitura automatizada, reprodutível, para os testes de suscetibilidade antifúngica com uso de Laranja de Acridina e FUN-1; 3- Foi verificada a importância da realização do teste da CML para verificar a ação protetora da melanina frente a combinação de AMB e 5FC. 4- A expressão da melanina, na combinação de AMB e 5FC reduz a detecção do sinergismo e o efeito aditivo in vitro. 5. Os isolados induzidos à resistência ao FLZ permitiram obter resultados estatisticamente significativos na verificação de Bombas de efluxo in vitro na CMF com uso de fluorocromo Dioc5 e bloqueador de protonóforos CCCP; 6- Foi verificado que 65% de isolados não induzidos a resistência e 90% de isolados induzidos a resistência do tipo molecular VGII expulsam o FLZ com certa vantagem em relação aos tipos moleculares VGI e VNI. Os resultados deste trabalho contribuem para compreensão do comportamento in vitro de C. neoformans e C. gattii frente a drogas antifúngicas cujos resultados poderão ser aplicados em estudos clínicos de correlação in vitro e in vivo para melhor compreensão da terapêutica antifúngica da criptococose e validação dos testes de suscetibilidade para estas duas espécies