Establishing a Robust In Vitro Embryonic Stem Cell Differentiation Assay to Monitor the Hematopoietic Potential of DELES Clones

Afin d’effectuer des études fonctionnelles sur le génome de la souris, notre laboratoire a généré une bibliothèque de clones de cellules souches embryonnaires (ESC) présentant des suppressions chromosomiques chevauchantes aléatoires – la bibliothèque DELES. Cette bibliothèque contient des délétions couvrant environ 25% du génome murin. Dans le laboratoire, nous comptons identifier de nouveaux déterminants du destin des cellules hématopoïétiques en utilisant cet outil. Un crible primaire utilisant la benzidine pour démontrer la présence d'hémoglobine dans des corps embryoïdes (EBS) a permis d’identifier plusieurs clones délétés présentant un phénotype hématopoïétique anormal. Comme cet essai ne vérifie que la présence d'hémoglobine, le but de mon projet est d'établir un essai in vitro de différenciation des ESC permettant de mesurer le potentiel hématopoïétique de clones DELES. Mon hypothèse est que l’essai de différenciation hématopoïétique publié par le Dr Keller peut être importé dans notre laboratoire et utilisé pour étudier l'engagement hématopoïétique des clones DELES. À l’aide d’essais de RT-QPCR et de FACS, j’ai pu contrôler la cinétique de différenciation hématopoïétique en suivant l’expression des gènes hématopoïétiques et des marqueurs de surface comme CD41, c-kit, RUNX1, GATA2, CD45, β-globine 1 et TER-119. Cet essai sera utilisé pour valider le potentiel hématopoïétique des clones DELES candidats identifiés dans le crible principal. Mon projet secondaire vise à utiliser la même stratégie rétro-virale a base de Cre-loxP utilisée pour générer la bibliothèque DELES pour générer une bibliothèque de cellules KBM-7 contenant des suppressions chromosomiques chevauchantes. Mon but ici est de tester si la lignée cellulaire leuémique humaine presque haploïde KBM-7 peut être exploitée en utilisant l'approche DELES pour créer cette bibliothèque. La bibliothèque de clones KBM-7 servira à définir les activités moléculaires de drogues anti-leucémiques potentielless que nous avons identifiées dans le laboratoire parce qu’elles inhibent la croissance cellulaire dans plusieurs échantillons de leucémie myéloïde aiguë dérivés de patients. Elle me permettra également d'identifier les voies de signalisation moléculaires qui, lorsque génétiquement perturbées, peuvent conférer une résistance à ces drogues.

Régulation de l'expression de PPARγ dans l'arthrose

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative très répondue touchant les articulations. Elle est caractérisée par la destruction progressive du cartilage articulaire, l’inflammation de la membrane synoviale et le remodelage de l’os sous chondral. L’étiologie de cette maladie n’est pas encore bien définie. Plusieurs études ont été menées pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l’OA. Les effets protecteurs du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes gamma (PPARγ) dans l'OA sont bien documentés. Il a été démontré que PPARγ possède des propriétés anti-inflammatoires et anti-cataboliques. Aussi, plusieurs stimuli ont été impliqués dans la régulation de l’expression de PPARγ dans différents types cellulaires. Cependant, les mécanismes exacts responsables de cette régulation ainsi que le profil de l’expression de ce récepteur au cours de la progression de l’OA ne sont pas bien connus. Dans la première partie de nos travaux, nous avons essayé d’élucider les mécanismes impliqués dans l’altération de l’expression de PPARγ dans cette maladie. Nos résultats ont confirmé l’implication de l’interleukine-1β (IL-1β), une cytokine pro-inflammatoire, dans la réduction de l’expression de PPARγ au niveau des chondrocytes du cartilage articulaire. Cet effet coïncide avec l'induction de l’expression du facteur de transcription à réponse précoce de type 1 (Egr-1). En plus, la diminution de l'expression de PPARγ a été associée au recrutement d'Egr-1 et la réduction concomitante de la liaison de Sp1 au niveau du promoteur de PPARγ. Dans la deuxième partie de nos travaux, nous avons évalué le profil d’expression de ce récepteur dans le cartilage au cours de la progression de cette maladie. Le cochon d’inde avec OA spontanée et le chien avec OA induite par rupture du ligament croisé antérieur (ACLT) deux modèles animaux d’OA ont été utilisés pour suivre l’expression des trois isoformes de PPARs : PPAR alpha (α), PPAR béta (β) et PPAR gamma (γ) ainsi que la prostaglandine D synthase hématopoïétique (H-PGDS) et la prostaglandine D synthase de type lipocaline (L-PGDS) deux enzymes impliquées dans la production de l’agoniste naturel de PPARγ, la 15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandine J(2) (15d-PGJ2). Nos résultats ont démontré des changements dans l’expression de PPARγ et la L-PGDS. En revanche, l’expression de PPARα, PPARβ et H-PGDS est restée stable au fil du temps. La diminution de l’expression de PPARγ dans le cartilage articulaire semble contribuer au développement de l’OA dans les deux modèles animaux. En effet, le traitement des chondrocytes par de siRNA dirigé contre PPARγ a favorisé la production des médiateurs arthrosiques tels que l'oxyde nitrique (NO) et la métalloprotéase matricielle de type 13 (MMP-13), confirmant ainsi le rôle anti-arthrosique de ce récepteur. Contrairement à ce dernier, le niveau d'expression de la L-PGDS a augmenté au cours de la progression de cette maladie. La surexpression de la L-PGDS au niveau des chondrocytes humains a été associée à la diminution de la production de ces médiateurs arthrosiques, suggérant son implication dans un processus de tentative de réparation. En conclusion, l’ensemble de nos résultats suggèrent que la modulation du niveau d’expression de PPARγ, de la L-PGDS et d’Egr-1 au niveau du cartilage articulaire pourrait constituer une voie thérapeutique potentielle dans le traitement de l’OA et probablement d’autres formes d'arthrite.

Mécanismes d'action des cellules stromales mésenchymateuses dans le traitement de la réaction du greffon contre l'hôte

La maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) est un effet secondaire sérieux de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (HSCT). Cette maladie entraine une haute mortalité et ses symptômes sont dévastateurs. Les traitements actuels de la GvHD comportent plusieurs produits, tels les corticostéroïdes, mais ces derniers sont immunosuppresseurs et leurs effets secondaires sont aussi très dommageables pour les patients et leur guérison. Les cellules stromales mésenchymateuses (MSC) représentent une alternative ou une addition potentielle de traitement pour la GvHD et ces cellules ne semblent pas posséder les effets secondaires des traitements classiques. Un nombre important d’études cliniques faisant l’objet des MSC ont été enregistrées. Malgré cet engouement, le mécanisme de leur immunomodulation reste encore à élucider. Notre objectif est donc de mieux définir ce mécanisme. Nous avons utilisé un modèle simplifié pour simuler la GvHD in vitro. Ce modèle se base sur la stimulation de lymphocytes CD4+ par des cellules dendritiques allogéniques. La mesure de la prolifération de ces cellules stimulées sert d’indicateur de leur réactivité. Selon les résultats obtenus par la technologie CRISPR de génie génétique, les MSC exerceraient leur immunosuppression sur les cellules T CD4+ principalement par la sécrétion de l’enzyme IDO1. Les MSC seraient également capables d’induire certaines cellules CD4+ en cellules régulatrices, un processus indépendant de la sécrétion d’IDO1. Toutefois, ces cellules ne semblent pas correspondre aux cellules Treg conventionnelles.

Les oncogènes NUP98-PHF23 et NUP98-HOXD13 confèrent un potentiel aberrant d’auto-renouvellement aux progéniteurs thymiques

L’initiation de la leucémogénèse dans la leucémie aigue lymphoblastique (LAL)-T résulte de l’activation aberrante de facteurs de transcription de la lignée lymphocytaire T. Nous démontrons que les gènes de fusion NUP98-PHF23 (NP23) et NUP98-HOXD13 (NHD13) reprogramment les thymocytes normaux en cellules souches pré-leucémiques (CS-préL) possédant un potentiel aberrant d’auto-renouvellement. Basé sur des essais de clonalité performés sur des thymocytes transplantés en série, nous avons découvert que cette population est hiérarchisée similairement aux cellules souches hématopoïétiques normales. Ces CS-préL dévoilent un enrichissement du compartiment de précurseurs thymiques immatures KIT+ où les deux oncogènes, NP23 et NHD13, activent des gènes impliqués dans l’autorenouvellement, incluant Hoxa9, Hoxa10, Lyl1 et Hhex. De plus, l’activité d’autorenouvellement est abrogée par les ARN interférents contre Lyl1 et Hhex, indiquant leur implication fonctionnelle en aval de NP23 et NHD13. Puisque ces gènes sont aussi activés en aval de trois autres oncogènes dans la LAL-T, SCL/TAL1, LMO1 et LMO2, nous concluons que les niveaux d’activation de Lyl1 et Hhex fixent le seuil de reprogrammation des thymocytes normaux en CS-préL. Malgré l'efficacité des traitements de chimiothérapie actuels à diminuer la masse tumorale, les CS-préL sont épargnées, pouvant mener à des rechutes. Nos résultats répondent à ce besoin et proposent de nouvelles avenues permettant de cibler les CS-préL du compartiment de thymocytes immatures dans la LAL-T.

Improving the use of G-CSF during chemotherapy using physiological mathematical modelling : a quantitative systems pharmacology approach

La diminution des doses administrées ou même la cessation complète d'un traitement chimiothérapeutique est souvent la conséquence de la réduction du nombre de neutrophiles, qui sont les globules blancs les plus fréquents dans le sang. Cette réduction dans le nombre absolu des neutrophiles, aussi connue sous le nom de myélosuppression, est précipitée par les effets létaux non spécifiques des médicaments anti-cancéreux, qui, parallèlement à leur effet thérapeutique, produisent aussi des effets toxiques sur les cellules saines. Dans le but d'atténuer cet impact myélosuppresseur, on administre aux patients un facteur de stimulation des colonies de granulocytes recombinant humain (rhG-CSF), une forme exogène du G-CSF, l'hormone responsable de la stimulation de la production des neutrophiles et de leurs libération dans la circulation sanguine. Bien que les bienfaits d'un traitement prophylactique avec le G-CSF pendant la chimiothérapie soient bien établis, les protocoles d'administration demeurent mal définis et sont fréquemment déterminés ad libitum par les cliniciens. Avec l'optique d'améliorer le dosage thérapeutique et rationaliser l'utilisation du rhG-CSF pendant le traitement chimiothérapeutique, nous avons développé un modèle physiologique du processus de granulopoïèse, qui incorpore les connaissances actuelles de pointe relatives à la production des neutrophiles des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse. À ce modèle physiologique, nous avons intégré des modèles pharmacocinétiques/pharmacodynamiques (PK/PD) de deux médicaments: le PM00104 (Zalypsis®), un médicament anti-cancéreux, et le rhG-CSF (filgrastim). En se servant des principes fondamentaux sous-jacents à la physiologie, nous avons estimé les paramètres de manière exhaustive sans devoir recourir à l'ajustement des données, ce qui nous a permis de prédire des données cliniques provenant de 172 patients soumis au protocol CHOP14 (6 cycles de chimiothérapie avec une période de 14 jours où l'administration du rhG-CSF se fait du jour 4 au jour 13 post-chimiothérapie). En utilisant ce modèle physio-PK/PD, nous avons démontré que le nombre d'administrations du rhG-CSF pourrait être réduit de dix (pratique actuelle) à quatre ou même trois administrations, à condition de retarder le début du traitement prophylactique par le rhG-CSF. Dans un souci d'applicabilité clinique de notre approche de modélisation, nous avons investigué l'impact de la variabilité PK présente dans une population de patients, sur les prédictions du modèle, en intégrant des modèles PK de population (Pop-PK) des deux médicaments. En considérant des cohortes de 500 patients in silico pour chacun des cinq scénarios de variabilité plausibles et en utilisant trois marqueurs cliniques, soient le temps au nadir des neutrophiles, la valeur du nadir, ainsi que l'aire sous la courbe concentration-effet, nous avons établi qu'il n'y avait aucune différence significative dans les prédictions du modèle entre le patient-type et la population. Ceci démontre la robustesse de l'approche que nous avons développée et qui s'apparente à une approche de pharmacologie quantitative des systèmes (QSP). Motivés par l'utilisation du rhG-CSF dans le traitement d'autres maladies, comme des pathologies périodiques telles que la neutropénie cyclique, nous avons ensuite soumis l'étude du modèle au contexte des maladies dynamiques. En mettant en évidence la non validité du paradigme de la rétroaction des cytokines pour l'administration exogène des mimétiques du G-CSF, nous avons développé un modèle physiologique PK/PD novateur comprenant les concentrations libres et liées du G-CSF. Ce nouveau modèle PK a aussi nécessité des changements dans le modèle PD puisqu’il nous a permis de retracer les concentrations du G-CSF lié aux neutrophiles. Nous avons démontré que l'hypothèse sous-jacente de l'équilibre entre la concentration libre et liée, selon la loi d'action de masse, n'est plus valide pour le G-CSF aux concentrations endogènes et mènerait en fait à la surestimation de la clairance rénale du médicament. En procédant ainsi, nous avons réussi à reproduire des données cliniques obtenues dans diverses conditions (l'administration exogène du G-CSF, l'administration du PM00104, CHOP14). Nous avons aussi fourni une explication logique des mécanismes responsables de la réponse physiologique aux deux médicaments. Finalement, afin de mettre en exergue l’approche intégrative en pharmacologie adoptée dans cette thèse, nous avons démontré sa valeur inestimable pour la mise en lumière et la reconstruction des systèmes vivants complexes, en faisant le parallèle avec d’autres disciplines scientifiques telles que la paléontologie et la forensique, où une approche semblable a largement fait ses preuves. Nous avons aussi discuté du potentiel de la pharmacologie quantitative des systèmes appliquées au développement du médicament et à la médecine translationnelle, en se servant du modèle physio-PK/PD que nous avons mis au point.

Traitement de la maladie du greffon contre l’hôte chronique par la photophérèse extra corporelle au TH9402 : m écanisme de régulation de la maladie du greffon contre l’hôte chronique par les cellules T régulatrices

La maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) est la principale cause de mortalité et de morbidité suite aux greffes de cellules souches hématopoïétiques. Plusieurs patients demeurent réfractaires aux traitements actuels ce qui rend nécessaire le développement de nouvelles stratégies afin de combattre cette maladie. Dans l’étude qui suit, nous avons utilisé un nouvel agent thérapeutique, le TH9402, une molécule photosensible et démontré qu’elle permet, lorsqu’exposée à la lumière visible (514 nm), d’éliminer sélectivement les cellules T activées in vivo tout en préservant les cellules T au repos et les cellules T régulatrices (Tregs). Les Tregs ainsi préservés peuvent abroger la réponse alloréactive par la sécrétion d’IL-10 ou par contact cellule-cellule via un mécanisme impliquant le CTLA-4. Nous avons découvert que la signalisation du CTLA-4 était associée à une hausse de la population Treg in vitro. Cette hausse est due à la conversion de cellules T CD4+CD25- en Tregs et non à une prolifération sélective des Tregs. Dans la deuxième partie de cette étude, nous avons démontré que la signalisation de CTLA-4 était associée à une augmentation de l’expression de la protéine Indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO). Ces effets nécessitent la déplétion du tryptophane ainsi que de la protéine de phase aigue GCN2. Finalement, nous avons observé que l’infusion de cellules traitées au TH9402 chez des patients souffrant de GVHD chronique est associée à une augmentation de la population Treg chez ces patients sans causer de lymphopénie ni de diminution de la réponse immunitaire dirigée contre les antigènes viraux. Ces résultats suggèrent que le traitement au TH9402 pourrait représenter une approche particulièrement intéressante pour le traitement de la GVHD chronique réfractaire aux traitements actuels. De plus, l’augmentation de l’expression d’IDO pourrait être utilisée comme valeur prédictive de la réponse du patient au traitement. Ceci pourrait permettre d’améliorer la qualité de soins ainsi que de la qualité de vie des patients souffrant de GVHD chronique.