Mécanismes de guidage des axones sérotoninergiques du raphé dorsal : études in vivo et in vitro

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caractérisation de HTDE et de son potentiel oncogénique in vitro et in vivo

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Effets préventifs et thérapeutiques des polyphénols dans un modèle in vitro et in vivo de maladie inflammatoire de l’intestin : caractérisation des polyphénols de la pelure de pomme et de la canneberge par spectrométrie de masse

La muqueuse intestinale est exposée à des agents oxydants provenant de l’ingestion d’aliments modifiés, de cellules immuno-inflammatoires et de la flore intestinale. Une diète élevée en fruits et légumes peut diminuer le stress oxydant (SOx) ainsi que l’inflammation via plusieurs mécanismes. Ces effets bénéfiques peuvent être attribuables à leur contenu élevé en polyphénols. La première étude de mon doctorat consistait à tester l’hypothèse que les polyphénols extraits de pelures de pomme (DAPP) pouvaient diminuer le stress oxydant et l'inflammation impliqués dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MII). Nous avons caractérisé les polyphénols des DAPP par spectrométrie de masse (LC-MS) et examiné leur potentiel antioxydant et anti-inflammatoire au niveau des cellules intestinales. L’identification des structures chimiques des polyphénols a été effectuée par LC-MS. Le SOx a été induit par l’ajout du complexe fer/ascorbate (Fe/Asc, 200 µM/2 mM) et l’inflammation par la lipopolysaccharide (LPS, 200µg/mL) à des cellules intestinales Caco-2/15 pré-incubées avec les DAPP (250 µg/mL). L’effet du SOx est déterminé par le dosage du malondialdéhyde (MDA), de la composition des acides gras polyinsaturés et de l’activité des enzymes antioxydantes endogènes (SOD et GPx). L’impact des DAPP sur l’inflammation a été testé par l’analyse de l’expression des marqueurs inflammatoires: cyclooxygénase-2 (COX-2), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-a et l’interleukine-6 (IL-6) et les facteurs de transcription NF-KB, Nrf-2 et PGC1α par immunobuvardage. Nos données ont montré que les flavonols et les flavan-3-ols constituent les composés polyphénoliques majoritaires des DAPP. L’ajout de Fer2+/Asc a provoqué une augmentation de la peroxidation lipidique comparativement aux cellules contrôles, un appauvrissement des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, et une modulation des enzymes antioxydantes, se traduisant par une augmentation de l’activité de la SOD et une diminution de la GPx. En contrepartie, les DAPP ont exhibé leur potentiel à corriger la plupart des perturbations, y compris l’expression protéique anormalement élevée du COX-2 et la production de la prostaglandine E2 (PGE2), ainsi que l’inflammation telle que réflétée par les facteurs NF-κB, TNF-α et IL-6. Par ailleurs, les mécanismes sous-jacents à ces changements bénéfiques des DAPP ont fait intervenir les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Vraisemblablement, cette première étude a permis de démontrer la capacité des DAPP à amoindrir le SOx et à réduire l’inflammation, deux processus étroitement impliqués dans les MII. Dans la deuxième étape de mon doctorat, nous avons voulu comparer les résultats de DAPP à ceux des polyphénols dérivant de la canneberge qui est considérée par la communauté scientifique comme le fruit ayant le plus fort potentiel antioxydant. À cette fin, nous avons caractérisé l’effet des composés polyphénoliques de la canneberge (CPC) sur le SOx, la défense antioxydante et l’inflammation au niveau intestinal tout en définissant leur métabolisme intraluminal. Les différents CPC ont été séparés selon leur poids moléculaire par chromatographie et leurs structures chimiques ont été identifiées par LC-MS. Suite à une pré-incubation des cellules Caco-2/15 avec les extraits CPC (250 µg/mL), le Fe/Asc et la LPS ont été administrés comme inducteurs du SOx et de l’inflammation, respectivement. La caractérisation globale des CPC a révélé que les acides phénoliques composaient majoritairement l’extrait de canneberge de petit poids moléculaire (LC) alors que les flavonoïdes et les procyanidines dimériques/trimériques représentaient l’extrait de poids moléculaire moyen (MC) tout en laissant les procyanidines oligo et polymériques à l’extrait de haut poids moléculaire (HC). Les CPC ont permis de restaurer la plupart des perturbations engendrées dans les Caco-2/15 par le Fe/Asc et le LPS. Les CPC exhibaient le potentiel d’abaisser les niveaux de MDA, de corriger la composition des acides gras polyinsaturés n-3 et n-6, d’augmenter l’activité des enzymes antioxydantes (SOD, GPx et CAT) et d’élever l’expression de Nrf2 et PGC1α. En outre, les CPC pouvaient aussi réduire les niveaux élevés des protéines inflammatoires COX-2, TNF-α et IL-6 ainsi que la production des PGE2 par un mécanisme impliquant le NF-κB. Au niveau mitochondrial, les procyanidines oligomériques ont réussi à corriger les dysfonctions reliées à la production d’énergie (ATP), l’apoptose (Bcl-2, Cyt C et AIF) et le statut des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). Dans le but de bien comprendre les mécanismes d’action des CPC, nous avons défini par LC-MS les composés polyphénoliques qui ont été transportés ou absorbés par l’entérocyte. Nos analyses soulignent le transport (i) des acides cinnamiques et benzoïques (LC); (ii) la quercétine glycosylée et conjuguée et les procyanidines dimériques de type A (MC); et (iii) l’épicatéchine et les procyanidines oligomériques (HC). Les processus de métabolisation (méthylation, glucuronidation et sulfatation) au niveau de l’entérocyte ont probablement permis le transport de ces CPC surtout sous leur forme conjuguée. Les procyanidines oligomériques ayant un degré de polymérisation supérieur à 2 (HC) ont semblé adhérer aux cellules Caco-2/15. L’épicatéchine suivi par les procyanidines dimériques de type A ont été trouvés majoritaires au niveau des mitochondries. Même si nous ignorons encore l’action biologique de chaque composé polyphénolique, nous pouvons suggérer que leurs effets combinatoires exercent des fonctions antioxydantes, anti-inflammatoires et mitochondriales dans le modèle intestinal Caco-2/15. Dans une troisième étape, nous avons procédé à l’évaluation des aspects préventifs et thérapeutique des DAPP tout en sondant les mécanismes sous-jacents dans une étude préclinique. À cette fin, nous avons exploité le modèle de souris avec colite expérimentale provoquée par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS). L’induction de l’inflammation intestinale chez la souris C57BL6 a été effectuée par l’administration orale de DSS à 2.5% pendant 10 jours. Des doses physiologiques et supra-physiologiques de DAPP (200 et 400 mg/kg/j, respectivement) ont été administrées par gavage pendant 10 jours pré- et post-DSS. L’inflammation par le DSS a provoqué une perte de poids, un raccourcissement du côlon, le décollement dystrophique de l’épithélium, l’exulcération et les infiltrations de cellules mono et polynucléaires au niveau du côlon. De plus, le DSS a induit une augmentation de la peroxidation lipidique, une régulation à la baisse des enzymes antioxydantes, une expression protéique à la hausse de la myéloperoxidase (MPO), du COX-2 et de la production des PGE2. Par ailleurs, les DAPP ont permis de corriger ou du moins d’alléger la plupart de ces anomalies en situation préventive ou thérapeutique, en plus d’abaisser l’expression protéique de NF-κB et des cytokines inflammatoires (TNF-a et l’IL-6) tout en stimulant les facteurs de transcription antioxydants (Nrf-2, PGC1α). Conséquemment, les polyphénols des DAPP ont exhibé leur puissant pouvoir antioxydant et anti-inflammatoire au niveau intestinal dans un modèle in vivo. Leurs actions sont associées à la régulation des voies de signalisation cellulaire et des changements dans la composition du microbiote. Ces trois projets de recherche permettent d’envisager l’évaluation des effets préventifs et thérapeutiques des DAPP cliniquement chez les patients avec des désordres inflammatoires de l’intestin.

Études in vivo et in vitro sur le potentiel néphroprotecteur de plantes médicinales anti-diabétiques de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Baie-James

Notre équipe a identifié le thé Labrador [Rhododendron groenlandicum L. (Ericaceae)] comme une plante potentiellement antidiabétique de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Baie James orientale. Dans la présente étude, nous avons évalué les effets néphroprotecteurs potentiels de la plante. De la microalbuminurie et de la fibrose rénale ont été développées chez des souris alimentées avec une diète grasse (DG). Le R. groenlandicum améliore d’une façon non-significative la microalbuminurie, avec des valeurs de l’aire sous la courbe (ACR) diminuant de 0.69 à 0.53. La valeur de la fibrose rénale qui était, à l’origine, de 4.85 unités arbitraires (UA) dans des souris alimentées à la DG, a chuté à 3.27 UA après avoir reçu un traitement de R. groenlandicum. Le R. groenlandicum a réduit la stéatose rénale de presque la moitié alors que l’expression du facteur de modification Bcl-2 (Bmf) a chuté de 13.96 UA à 9.43 UA. Dans leur ensemble les résultats suggèrent que le traitement avec R. groenlandicum peut améliorer la fonction rénale altérée par DG. Dans l’étude subséquente, notre équipe a identifié 17 espèces de la forêt boréale, de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Baie James orientale, qui ont présenté des activités biologiques prometteuses in vitro et in vivo dans le contexte du DT2. Nous avons maintenant examiné ces 17 extraits afin d’identifier lesquels possèdent un potentiel cytoprotecteur rénale en utilisant des cellules Madin Darby Canine Kidney (MDCK) mises à l’épreuve dans un médium hypertonique. Nous concluons que plusieurs plantes antidiabétiques Cris exercent une activité de protection rénale qui pourrait être pertinente dans le contexte de la néphropathie diabétique (ND) qui affecte une proportion importante des Cris. La G. hispidula et la A. balsamea sont parmi les plantes les plus puissantes dans ce contexte et elles semblent protectrices principalement en inhibant la caspase 9 dans la voie de signalisation apoptotique mitochondriale. Finalement, nous avons utilisé une approche de fractionnement guidée par un test biologique pour identifier les fractions actives et les composés de A. balsamea avec un potentiel de protection rénale in vitro dans des cellules MDCK mises au défi avec un médium hypertonique. La fraction d’hexane (Hex) possède le potentiel le plus élevé parmi toutes les fractions de solvant contre les dommages cellulaires induits par le stress hypertonique. Dans des études précédentes, trois composés purs ont été identifiés à partir de la fraction Hex, à savoir, l’acide abiétique, l’acide déhydroabiétique et le squalène. L’acide abiétique se distinguait par son effet puissant dans le maintien de la viabilité des cellules MDCK (AnnV-/PI-) à un niveau relativement élevé (augmentation de 25.48% relative au stress hypertonique, P<0.0001), ainsi qu’une réduction significative (diminution de 20.20% par rapport au stress hypertonique, P<0.0001) de l’apoptose de stade précoce (AnnV+/PI-). L’acide abiétique peut donc servir à normaliser les préparations traditionnelles d’A. balsamea et à trouver des applications potentielles dans le traitement de la néphropathie diabétique. Les trois études ont été intrinsèquement liées les unes aux autres, par conséquent, nous avons réussi à identifier R. groenlandicum ainsi que A. balsamea comme nouvelles plantes prometteuses contre la néphropathie diabétique. Nous croyons que ces résultats profiteront à la communauté crie pour la gestion des complications diabétiques, en particulier la néphropathie diabétique. En parallèle, nos données pourraient faire avancer l'essai clinique de certaines plantes médicinales de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Baie James orientale du Canada.

L'étude in vivo de l'impact de la pression pulsée sur les capillaires cérébraux de souris

Plusieurs décennies de recherche ont permis de mieux comprendre les effets de l’athérosclérose sur le système cardiovasculaire, d’améliorer la prévention et de développer des traitements efficaces. Les effets de l’athéroslérose sur le cerveau demeurent toutefois mal compris même si le lien entre le fonctionnement cognitif et la santé du système vasculaire est maintenant bien établi. La venue de nouvelles méthodes d’imagerie telle la microscopie laser à 2-photons (TPLM) permet d’étudier l’impact de certaines maladies sur la microvasculature cérébrale en mesurant le flux sanguin dans des vaisseaux uniques situés dans des régions cérébrales millimétriques sous la surface. Les résultats des études in vitro peuvent dorénavant être corrélés à ceux obtenus in vivo. En premier lieu, ce mémoire revoit la théorie ayant permis le développement de la TPLM qui permet de prendre des mesures hémodynamiques in vivo dans des vaisseaux de très petits calibres tels des capillaires cérébraux de souris. Par la suite, son utilisation est décrite chez des souris anesthésiées afin de comparer les mesures d’hémodynamie cérébrale tels la vitesse des globules rouges, le flux de globules rouges, le flux sanguin cérébral, l’hématocrite sanguin et le diamètre des vaisseaux. Finalement, nous avons comparé les données hémodynamiques entre des souris de 3 mois normales (WT ; n=6) et des souris atteintes d’athérosclérose précoce (ATX ; n=6). Les résultats obtenus sur un nombre total de 209 capillaires (103 pour les souris WT et 106 pour les souris ATX) démontrent que les souris ATX possèdent une vitesse des globules rouges (+40%) plus grande, un flux de globule rouge plus grand (+12%) et un flux capillaire plus élevé (+14%) sans démontrer pour aucun de ces paramètres, une différence statistiquement significative. L’hématocrite moyen (35±4% vs 33±2% ; p=0.71) et le diamètre moyen des vaisseaux (4.88±0.22μm vs 4.86±0.20μm ; p=0.23) étaient également comparables. La vitesse des globules rouges a démontré une faible corrélation avec le diamètre des vaisseaux (r=0.39) et avec le flux de globules rouges/seconde (r=0.59). En conclusion, les travaux menés dans le cadre de ce mémoire de maîtrise permettent d'envisager, grâce aux nouvelles méthodes d’imagerie cérébrale telle la TPLM, une meilleure compréhension des mécanismes hémodynamiques sous-jacents à la microcirculation cérébrale. L’effet d’une pression pulsée augmentée, tel que proposée dans l’athérosclérose reste cependant à démontrer avec cette méthode d’imagerie.

Fonctionnalité in vivo d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de cellules endothéliales cornéennes dans la chambre antérieure d’un modèle félin

Introduction : Malgré leur état non-prolifératif in vivo, les cellules endothéliales cornéennes (CEC) peuvent être amplifiées in vitro. Leur transplantation subséquente par injection intracamérale pourrait surmonter la pénurie de tissus associée à l’allo-greffe traditionnelle – l’unique traitement définitif disponible pour les endothéliopathies cornéennes. Objectif : Évaluer la fonctionnalité d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de CEC dans la chambre antérieure du félin. Méthodes : Les yeux droits de 16 animaux ont été opérés. Huit ont été désendothélialisés centralement avec injection de 2x10e5 (n=4) ou 1x10e6 (n=4) CEC félines supplémentées avec Y-27632 et marquées avec SP-DiOC18(3). Deux ont été désendothélialisés complètement et injectés avec 1x10e6 CEC et Y-27632. Six contrôles ont été désendothélialisés centralement (n=3) ou complètement (n=3) et injectés avec Y-27632 sans CEC. La performance clinique, l’intégrité anatomique, le phénotype fonctionnel et l’expression de SP-DiOC18(3) du nouvel endothélium ont été étudiés. Résultats : Les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement ont réussi le mieux cliniquement. Les contrôles désendothélialisés complètement sont restés opaques. L’histopathologie a révélé une monocouche endothéliale fonctionnelle dans les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement, une multicouche endothéliale non-fonctionnelle dans les cornées désendothélialisées centralement et greffées avec 1x10e6 CEC, et un endothélium fibrotique non-fonctionnel dans les cornées désendothélialisées complètement. L’expression de SP-DiOC18(3) était rare dans les greffes. Conclusion : La thérapie par injection cellulaire a reconstitué un endothélium partiellement fonctionnel, auquel les CEC injectées n’ont contribué que peu. L’injection de Y-27632 sans CEC a reconstitué l’endothélium le plus sain. Des études additionnelles investiguant l’effet thérapeutique de Y-27632 seul sont justifiées.