Establishing a Robust In Vitro Embryonic Stem Cell Differentiation Assay to Monitor the Hematopoietic Potential of DELES Clones

Afin d’effectuer des études fonctionnelles sur le génome de la souris, notre laboratoire a généré une bibliothèque de clones de cellules souches embryonnaires (ESC) présentant des suppressions chromosomiques chevauchantes aléatoires – la bibliothèque DELES. Cette bibliothèque contient des délétions couvrant environ 25% du génome murin. Dans le laboratoire, nous comptons identifier de nouveaux déterminants du destin des cellules hématopoïétiques en utilisant cet outil. Un crible primaire utilisant la benzidine pour démontrer la présence d'hémoglobine dans des corps embryoïdes (EBS) a permis d’identifier plusieurs clones délétés présentant un phénotype hématopoïétique anormal. Comme cet essai ne vérifie que la présence d'hémoglobine, le but de mon projet est d'établir un essai in vitro de différenciation des ESC permettant de mesurer le potentiel hématopoïétique de clones DELES. Mon hypothèse est que l’essai de différenciation hématopoïétique publié par le Dr Keller peut être importé dans notre laboratoire et utilisé pour étudier l'engagement hématopoïétique des clones DELES. À l’aide d’essais de RT-QPCR et de FACS, j’ai pu contrôler la cinétique de différenciation hématopoïétique en suivant l’expression des gènes hématopoïétiques et des marqueurs de surface comme CD41, c-kit, RUNX1, GATA2, CD45, β-globine 1 et TER-119. Cet essai sera utilisé pour valider le potentiel hématopoïétique des clones DELES candidats identifiés dans le crible principal. Mon projet secondaire vise à utiliser la même stratégie rétro-virale a base de Cre-loxP utilisée pour générer la bibliothèque DELES pour générer une bibliothèque de cellules KBM-7 contenant des suppressions chromosomiques chevauchantes. Mon but ici est de tester si la lignée cellulaire leuémique humaine presque haploïde KBM-7 peut être exploitée en utilisant l'approche DELES pour créer cette bibliothèque. La bibliothèque de clones KBM-7 servira à définir les activités moléculaires de drogues anti-leucémiques potentielless que nous avons identifiées dans le laboratoire parce qu’elles inhibent la croissance cellulaire dans plusieurs échantillons de leucémie myéloïde aiguë dérivés de patients. Elle me permettra également d'identifier les voies de signalisation moléculaires qui, lorsque génétiquement perturbées, peuvent conférer une résistance à ces drogues.

The human organic cation transporter OCT1 mediates high affinity uptake of the anticancer drug daunorubicin

Les anthracyclines tels que la doxorubicin et la daunorubicin sont une famille de médicaments anticancéreux hydrophiles qui doivent être transportés dans les cellules afin d’exercer leur action par intercalation à l’ADN dans le noyau cellulaire. Ceci mène à la perturbation du métabolisme de l’ADN et entraine la mort cellulaire. Les anthracyclines sont utilisés pour le traitement d’une variété de cancers incluant la leucémie, les lymphomes, le cancer du sein, le cancer des poumons et le cancer des ovaires. Étant donné que le transport actif des anthracyclines dans les cellules a partiellement été démontré, le transporteur spécifique impliqué dans ce processus n’est pas encore connu. En utilisant un modèle de cancer des ovaires, la lignée cellulaire TOV2223G, nous avons démontré que des substrats spécifiques au transporteur de cations organiques 1 (OCT1), notamment la ergothionéine, la thiamine et la phenformin, ont partiellement inhibé l’absorption de la daunorubicin en différence de la carnitine qui est un substrat de haute affinité des transporteurs CT2 et OCTN2. Ces résultats suggèrent que les transporteurs organiques spécifiques au transport de la carnitine ne sont pas impliqués dans le transport des anthracyclines. Ainsi, nos résultats ont démontré que l’absorption de la daunorubicin est orchestrée par le transporteur OCT1 dans les cellules TOV2223G (Km ~ 5 μM) et des concentrations micromolaires de choline ont complètement abolies l’absorption de la drogue. De plus, un ARN sh dirigé contre OCT1 a réprimé son expression protéique, ce qui a été confirmé par la technique d’immuno-buvardage en utilisant un anti-OCT1 anticorps. Les cellules déficientes en OCT1 n’ont pas été capables d’absorber la daunorubicin et ont été plus résistantes à l’action de la drogue par rapport aux cellules contrôle. La transfection des cellules HEK293T avec un plasmide construit de façon à faire exprimer OCT1 comme protéine de fusion avec la protéine fluorescente EYFP a montré que celle-ci est localisée dans la membrane plasmique. Les cellules transfectées ont été capables d’absorber cinq fois plus de daunorubicin comparé aux cellules contrôles. Cette étude est, selon nous, la première à démontrer que OCT1 est un transporteur de haute affinité des anthracyclines. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que des défauts de OCT1 peuvent contribuer à l’efficacité de la réponse des cellules cancéreuses à la chimiothérapie avec les anthracyclines.