Études d'ingénierie du ribozyme VS de Neurospora

Les ribozymes sont des ARN catalytiques fréquemment exploités pour le développement d’outils biochimiques et d’agents thérapeutiques. Ils sont particulièrement intéressants pour effectuer l’inactivation de gènes, en permettant la dégradation d’ARNm ou d’ARN viraux associés à des maladies. Les ribozymes les plus utilisés en ce moment pour le développement d’agents thérapeutiques sont les ribozymes hammerhead et hairpin, qui permettent la reconnaissance spécifique d’ARN simple brin par la formation de structures secondaires stables. In vivo, la majorité des ARN adoptent des structures secondaires et tertiaires complexes et les régions simples brins sont parfois difficiles d’accès. Il serait intéressant de pouvoir cibler des ARN repliés et un motif d’ARN intéressant à cibler est la tige-boucle d’ARN qui peut être importante dans le repliement global des ARN et pour accomplir des fonctions biologiques. Le ribozyme VS de Neurospora fait la reconnaissance de son substrat replié en tigeboucle de façon spécifique par une interaction kissing-loop, mais il n’a jamais été exploité pour faire la reconnaissance d’un ARN cible très différent de son substrat naturel. Le but des travaux présentés dans cette thèse est de déterminer si le ribozyme VS possède l’adaptabilité nécessaire pour l’ingénierie de ribozymes qui clivent des ARN cibles différents du substrat naturel. Dans le cadre de cette thèse, le ribozyme VS a été modifié pour l’adapter à différents substrats et des études de cinétiques ont été réalisées pour évaluer l’impact de ces modifications sur l’activité de clivage du ribozyme. Dans un premier temps, le ribozyme a été modifié pour faire la reconnaissance et le clivage de substrats possédant différentes longueurs de tiges Ib. Le ribozyme a été adapté avec succès à ces substrats de différentes longueurs de tige Ib, avec une activité qui est similaire à celle du ribozyme avec un substrat sans modification. Dans un deuxième temps, c’est l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme qui a été substituée de façon rationnelle, dans le but de savoir si un ribozyme VS mutant peut reconnaitre et cliver un substrat ayant une boucle différente de celle de son substrat naturel. L’interaction kissing-loop I/V a été substituée pour les interactions kissing-loop TAR/TAR* de l’ARN du VIH-1 et L22/L88 de l’ARN 23S de Deinococcus radiodurans. La réaction de iii clivage des ribozymes comportant ces nouvelles interactions kissing-loop est toujours observée, mais avec une activité diminuée. Finalement, la sélection in vitro (SELEX) de ribozymes a été effectuée pour permettre un clivage plus efficace d’un substrat mutant avec une nouvelle boucle. Le SELEX a permis la sélection d’un ribozyme qui clive un substrat avec une boucle terminale mutée pour celle de l’ARN TAR du VIH-1 et cela avec une activité de clivage très efficace. L’ensemble de ces études démontre que le ribozyme VS peut être modifié de diverses façons pour la reconnaissance spécifique de différents substrats, tout en conservant une bonne activité de clivage. Ces résultats montrent le grand potentiel d’ingénierie du ribozyme VS et sont prometteurs pour la poursuite d’études d’ingénierie du ribozyme VS, en vue du clivage d’ARN cibles repliés en tige-boucle complètement différents du substrat naturel du ribozyme VS.

Caractérisation des structures de septines hautement organisées chez la drosophile et leur interaction avec le cytosquelette d’actine

Les septines sont des GTPases conservées dérégulées dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Elles servent de protéines d’échafaudage et forment une barrière de diffusion à la membrane plasmique et au corps central lors de la cytokinèse. Elles interagissent avec l’actine et s’organisent en complexes qui polymérisent et forment des structures hautement organisées (anneaux et filaments). Leur dynamique d’assemblage et leur rôle dans la cellule restent à être élucidés. La Drosophile est un modèle simple pour l’étude des septines puisqu’on n’y retrouve que 5 gènes (sep1, sep2, sep4, sep5, peanut) comparativement aux 13 gènes chez l’humain. À l’aide d’un anticorps contre Pnut, nous avons identifié des structures tubulaires dans 30% des cellules S2 de Drosophile. Mon projet a comme but de caractériser ces tubes en élucidant leurs constituants, leur comportement et leurs propriétés pour mieux clarifier le mécanisme par lequel les septines forment des structures hautement organisées et interagissent avec le cytosquelette d’actine. Par immunofluorescence, j’ai pu démontrer que ces tubes sont cytoplasmiques, en mitose ou interphase, ce qui suggère qu’ils ne sont pas régulés par le cycle cellulaire. Pour investiguer la composition et les propriétés dynamiques de ces tubes, j’ai généré une lignée cellulaire exprimant Sep2-GFP qui se localise aux tubes et des ARNi contre les cinq septines. Trois septines sont importantes pour la formation de ces tubes et anneaux notamment Sep1, Sep2 et Pnut. La déplétion de Sep1 cause la dispersion du signal GFP en flocons, tandis que la déplétion de Sep2 ou de Pnut mène à la dispersion du signal GFP uniformément dans la cellule. Des expériences de FRAP sur la lignée Sep2-GFP révèlent un signal de retour très lent, ce qui indique que ces structures sont très stables. J’ai aussi démontré une relation entre l’actine et les septines. Le traitement avec la Latrunculin A (un inhibiteur de la polymérisation de l’actine) ou la Jasplakinolide (un stabilisateur des filaments d’actine) mène à la dépolymérisation rapide (< 30 min) des tubes en anneaux flottants dans le cytoplasme, même si ces tubes ne sont pas reconnus suite à un marquage de la F-actine. L’Actin05C-mCherry se localise aux tubes, tandis que le mutant déficient de la polymérisation, Actin05C-R62D-mCherry perd cette localisation. On observe aussi que la déplétion de la Cofiline et de l’AIP1 (ce qui déstabilise l’actine) mène au même phénotype que le traitement avec la Latrunculine A ou la Jasplakinolide. Alors on peut conclure qu’un cytosquelette d’actine dynamique est nécessaire pour la formation et le maintien des tubes de septines. Les futures études auront comme but de mieux comprendre l’organisation des septines en structures hautement organisées et leur relation avec l’actine. Ceci sera utile pour l’élaboration du réseau d’interactions des septines qui pourra servir à expliquer leur dérégulation dans le cancer et les maladies neurodégénératives.