La tagatose-1,6-bisphosphate aldolase et la fructose-1,6-bisphosphate aldolase de classe I : mécanisme et stéréospécificité

La tagatose-1,6-biphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase qui fait preuve d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses substrats. En effet, elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-bisphosphate (TBP), mais également du fructose-1,6-bisphosphate (FBP), du sorbose-1,6-bisphosphate et du psicose-1,6-bisphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Aldolase de classe I, qui donc catalyse sa réaction en formant un intermédiaire covalent obligatoire, ou base de Schiff, avec son susbtrat, la TBP aldolase de S. pyogenes partage 14 % d’identité avec l’enzyme modèle de cette famille, la FBP aldolase de muscle de mammifère. Bien que le mécanime catalytique de la FBP aldolase des mammifères ait été examiné en détails et qu’il soit approprié d’en tirer des renseignements quant à celui de la TBP aldolase, le manque singulier de stéréospécificité de cette dernière tant dans le sens du clivage que celui de la condensation n’est toujours pas éclairci. Afin de mettre à jour les caractéristiques du mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution des structures de l’enzyme native et mutée, en complexe avec des subtrats et des inhibiteurs compétitifs, à des résolutions comprises entre 1.8 Å et 2.5 Å. Le trempage des cristaux de TBP aldolase native et mutante dans une solution saturante de FBP ou TBP a en outre permis de piéger un authentique intermédiaire covalent lié à la Lys205, la lysine catalytique. La determination des profils pH de la TBP aldolase native et mutée, entreprise afin d'évaluer l’influence du pH sur la réaction de clivage du FBP et TBP et ìdentifier le(s) résidu(s) impliqué(s), en conjonction avec les données structurales apportées par la cristallographie, ont permis d’identifier sans équivoque Glu163 comme résidu responsable du clivage. En effet, le mode de liaison sensiblement différent des ligands utilisés selon la stéréochimie en leur C3 et C4 permet à Glu163, équivalent à Glu187 dans la FBP aldolase de classe I, d’abstraire le proton sur l’hydroxyle du C4 et ainsi d’amorcer le clivage du lien C3-C4. L’étude du mécanimse inverse, celui de la condensation, grâce par exemple à la structure de l’enzyme native en complexe avec ses substrats à trois carbones le DHAP et le G3P, a en outre permis d’identifier un isomérisme du substrat G3P comme possible cause de la synthèse des isomères en C4 par cette enzyme. Ce résultat, ainsi que la decouverte d’un possible isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP, identifié précedemment, permet de cerner presque complètement les particularités du mécanisme de cette enzyme et d’expliquer comment elle est capable de synthétiser les quatres stéréoisomères 3(S/R), 4(S/R). De plus, la résolution de ces structures a permis de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression génétique et de la virulence de la bactérie. Enfin, la résolution de la structure du mutant Lys229→Met de la FBP aldolase de muscle en complexe avec la forme cyclique du FBP, de même que des études cristallographiques sur le mutant équivalent Lys205→Met de la TBP aldolase de S. pyogenes et des expériences de calorimétrie ont permis d’identifier deux résidus particuliers, Ala31 et Asp33 chez la FBP aldolase, comme possible cause de la discrimination de cette enzyme contre les substrats 3(R) et 4(S), et ce par encombrement stérique des substrats cycliques. La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux caractéristiques particulières.

Détermination de la spéciation du samarium dans l'environnement

Les éléments de terres rares (REEs) sont de plus en plus utilisés dans une multitude d’applications, notamment la fabrication d’aimants, de batteries rechargeables et les écrans de téléviseurs. Ils sont pour la plupart des métaux trivalents peu solubles dans les eaux naturelles. Comme pour les métaux divalents, le risque écologique des REEs est très probablement étroitement lié à leurs spéciations chimiques. Cependant, le comportement du samarium (Sm) dans les matrices environnementales est très peu connu et il n'existe actuellement aucune technique pour évaluer sa spéciation chimique. Dans cette optique, la technique d'échange d'ions (IET) sur la résine Dowex a été optimisée pour mesurer le samarium libre en solution. Les temps d'équilibre ont d'abord été déterminés pour des solutions tamponnées de samarium (Sm 6,7x10-8 M ; MES 1,0 mM M ; pH 6,0) en présence du nitrate de sodium (de 0,01M à 0,5 M). Pour ces diverses forces ioniques, l’équilibre thermodynamique n’est atteint que pour NaNO3 0,5M. Un autre mode d’utilisation de la résine (mode dynamique) a donc été développé pour tenir compte des conditions environnementales et évaluer efficacement le samarium libre. Les impacts des ligands organiques tels le NTA, l’EDTA, le citrate, l’acide malique et l’acide fulvique Suwannee River Standard I (SRFA) ont été étudiés par l’IET en mode dynamique. Une grande corrélation a été trouvée plus entre les taux d’accumulation de samarium sur la résine d’échange pour différents rapports NTA : Sm, EDTA : Sm, SRFA : Sm et le samarium libre. Par contre, aucune corrélation significative n’a été observée pour les ligands citrate et acide malique compte tenu des complexes qu’ils forment avec le samarium et qui s’adsorbent aussi sur la résine Dowex. Les concentrations Sm3+ mesurées par la technique IET ont été fortement corrélées avec celles prédites par le modèle WHAM 7.0 en utilisant la constante de stabilité obtenue par titration de SRFA par extinction de la fluorescence. Par ailleurs, la formation de colloïdes de samarium en fonction du pH influe grandement sur la détermination du samarium libre et doit être prise en compte dans la spéciation du samarium. L'IET assisté par des techniques auxiliaires comme le dosage par extinction de la fluorescence et le SP-ICPMS pourrait être une technique utile pour évaluer les concentrations de Sm biodisponible dans les eaux naturelles.