Mechanisms underlying activation of neural stem cells in the adult central nervous system

À la fin du 19e siècle, Dr. Ramón y Cajal, un pionnier scientifique, a découvert les éléments cellulaires individuels, appelés neurones, composant le système nerveux. Il a également remarqué la complexité de ce système et a mentionné l’impossibilité de ces nouveaux neurones à être intégrés dans le système nerveux adulte. Une de ses citations reconnues : “Dans les centres adultes, les chemins nerveux sont fixes, terminés, immuables. Tout doit mourir, rien ne peut être régénérer” est représentative du dogme de l’époque (Ramón y Cajal 1928). D’importantes études effectuées dans les années 1960-1970 suggèrent un point de vue différent. Il a été démontré que les nouveaux neurones peuvent être générés à l’âge adulte, mais cette découverte a créé un scepticisme omniprésent au sein de la communauté scientifique. Il a fallu 30 ans pour que le concept de neurogenèse adulte soit largement accepté. Cette découverte, en plus de nombreuses avancées techniques, a ouvert la porte à de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour les maladies neurodégénératives. Les cellules souches neurales (CSNs) adultes résident principalement dans deux niches du cerveau : la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et le gyrus dentelé de l’hippocampe. En condition physiologique, le niveau de neurogenèse est relativement élevé dans la zone sous-ventriculaire contrairement à l’hippocampe où certaines étapes sont limitantes. En revanche, la moelle épinière est plutôt définie comme un environnement en quiescence. Une des principales questions qui a été soulevée suite à ces découvertes est : comment peut-on activer les CSNs adultes afin d’augmenter les niveaux de neurogenèse ? Dans l’hippocampe, la capacité de l’environnement enrichi (incluant la stimulation cognitive, l’exercice et les interactions sociales) à promouvoir la neurogenèse hippocampale a déjà été démontrée. La plasticité de cette région est importante, car elle peut jouer un rôle clé dans la récupération de déficits au niveau de la mémoire et l’apprentissage. Dans la moelle épinière, des études effectuées in vitro ont démontré que les cellules épendymaires situées autour du canal central ont des capacités d’auto-renouvellement et de multipotence (neurones, astrocytes, oligodendrocytes). Il est intéressant de noter qu’in vivo, suite à une lésion de la moelle épinière, les cellules épendymaires sont activées, peuvent s’auto-renouveller, mais peuvent seulement ii donner naissance à des cellules de type gliale (astrocytes et oligodendrocytes). Cette nouvelle fonction post-lésion démontre que la plasticité est encore possible dans un environnement en quiescence et peut être exploité afin de développer des stratégies de réparation endogènes dans la moelle épinière. Les CSNs adultes jouent un rôle important dans le maintien des fonctions physiologiques du cerveau sain et dans la réparation neuronale suite à une lésion. Cependant, il y a peu de données sur les mécanismes qui permettent l'activation des CSNs en quiescence permettant de maintenir ces fonctions. L'objectif général est d'élucider les mécanismes sous-jacents à l'activation des CSNs dans le système nerveux central adulte. Pour répondre à cet objectif, nous avons mis en place deux approches complémentaires chez les souris adultes : 1) L'activation des CSNs hippocampales par l'environnement enrichi (EE) et 2) l'activation des CSNs de la moelle épinière par la neuroinflammation suite à une lésion. De plus, 3) afin d’obtenir plus d’information sur les mécanismes moléculaires de ces modèles, nous utiliserons des approches transcriptomiques afin d’ouvrir de nouvelles perspectives. Le premier projet consiste à établir de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires à travers lesquels l’environnement enrichi module la plasticité du cerveau adulte. Nous avons tout d’abord évalué la contribution de chacune des composantes de l’environnement enrichi à la neurogenèse hippocampale (Chapitre II). L’exercice volontaire promeut la neurogenèse, tandis que le contexte social augmente l’activation neuronale. Par la suite, nous avons déterminé l’effet de ces composantes sur les performances comportementales et sur le transcriptome à l’aide d’un labyrinthe radial à huit bras afin d’évaluer la mémoire spatiale et un test de reconnaissante d’objets nouveaux ainsi qu’un RNA-Seq, respectivement (Chapitre III). Les coureurs ont démontré une mémoire spatiale de rappel à court-terme plus forte, tandis que les souris exposées aux interactions sociales ont eu une plus grande flexibilité cognitive à abandonner leurs anciens souvenirs. Étonnamment, l’analyse du RNA-Seq a permis d’identifier des différences claires dans l’expression des transcripts entre les coureurs de courte et longue distance, en plus des souris sociales (dans l’environnement complexe). iii Le second projet consiste à découvrir comment les cellules épendymaires acquièrent les propriétés des CSNs in vitro ou la multipotence suite aux lésions in vivo (Chapitre IV). Une analyse du RNA-Seq a révélé que le transforming growth factor-β1 (TGF-β1) agit comme un régulateur, en amont des changements significatifs suite à une lésion de la moelle épinière. Nous avons alors confirmé la présence de cette cytokine suite à la lésion et caractérisé son rôle sur la prolifération, différentiation, et survie des cellules initiatrices de neurosphères de la moelle épinière. Nos résultats suggèrent que TGF-β1 régule l’acquisition et l’expression des propriétés de cellules souches sur les cellules épendymaires provenant de la moelle épinière.

Epigenetic reprogramming of imprinted genes in embryonic stem cells, fertilized and cloned embryos

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Development of a retroviral strategy that efficiently creates nested chromosomal deletions in mouse embryonic stem cells and its exploitation for functional genomics

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les oncogènes NUP98-PHF23 et NUP98-HOXD13 confèrent un potentiel aberrant d’auto-renouvellement aux progéniteurs thymiques

L’initiation de la leucémogénèse dans la leucémie aigue lymphoblastique (LAL)-T résulte de l’activation aberrante de facteurs de transcription de la lignée lymphocytaire T. Nous démontrons que les gènes de fusion NUP98-PHF23 (NP23) et NUP98-HOXD13 (NHD13) reprogramment les thymocytes normaux en cellules souches pré-leucémiques (CS-préL) possédant un potentiel aberrant d’auto-renouvellement. Basé sur des essais de clonalité performés sur des thymocytes transplantés en série, nous avons découvert que cette population est hiérarchisée similairement aux cellules souches hématopoïétiques normales. Ces CS-préL dévoilent un enrichissement du compartiment de précurseurs thymiques immatures KIT+ où les deux oncogènes, NP23 et NHD13, activent des gènes impliqués dans l’autorenouvellement, incluant Hoxa9, Hoxa10, Lyl1 et Hhex. De plus, l’activité d’autorenouvellement est abrogée par les ARN interférents contre Lyl1 et Hhex, indiquant leur implication fonctionnelle en aval de NP23 et NHD13. Puisque ces gènes sont aussi activés en aval de trois autres oncogènes dans la LAL-T, SCL/TAL1, LMO1 et LMO2, nous concluons que les niveaux d’activation de Lyl1 et Hhex fixent le seuil de reprogrammation des thymocytes normaux en CS-préL. Malgré l'efficacité des traitements de chimiothérapie actuels à diminuer la masse tumorale, les CS-préL sont épargnées, pouvant mener à des rechutes. Nos résultats répondent à ce besoin et proposent de nouvelles avenues permettant de cibler les CS-préL du compartiment de thymocytes immatures dans la LAL-T.

Improving the use of G-CSF during chemotherapy using physiological mathematical modelling : a quantitative systems pharmacology approach

La diminution des doses administrées ou même la cessation complète d'un traitement chimiothérapeutique est souvent la conséquence de la réduction du nombre de neutrophiles, qui sont les globules blancs les plus fréquents dans le sang. Cette réduction dans le nombre absolu des neutrophiles, aussi connue sous le nom de myélosuppression, est précipitée par les effets létaux non spécifiques des médicaments anti-cancéreux, qui, parallèlement à leur effet thérapeutique, produisent aussi des effets toxiques sur les cellules saines. Dans le but d'atténuer cet impact myélosuppresseur, on administre aux patients un facteur de stimulation des colonies de granulocytes recombinant humain (rhG-CSF), une forme exogène du G-CSF, l'hormone responsable de la stimulation de la production des neutrophiles et de leurs libération dans la circulation sanguine. Bien que les bienfaits d'un traitement prophylactique avec le G-CSF pendant la chimiothérapie soient bien établis, les protocoles d'administration demeurent mal définis et sont fréquemment déterminés ad libitum par les cliniciens. Avec l'optique d'améliorer le dosage thérapeutique et rationaliser l'utilisation du rhG-CSF pendant le traitement chimiothérapeutique, nous avons développé un modèle physiologique du processus de granulopoïèse, qui incorpore les connaissances actuelles de pointe relatives à la production des neutrophiles des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse. À ce modèle physiologique, nous avons intégré des modèles pharmacocinétiques/pharmacodynamiques (PK/PD) de deux médicaments: le PM00104 (Zalypsis®), un médicament anti-cancéreux, et le rhG-CSF (filgrastim). En se servant des principes fondamentaux sous-jacents à la physiologie, nous avons estimé les paramètres de manière exhaustive sans devoir recourir à l'ajustement des données, ce qui nous a permis de prédire des données cliniques provenant de 172 patients soumis au protocol CHOP14 (6 cycles de chimiothérapie avec une période de 14 jours où l'administration du rhG-CSF se fait du jour 4 au jour 13 post-chimiothérapie). En utilisant ce modèle physio-PK/PD, nous avons démontré que le nombre d'administrations du rhG-CSF pourrait être réduit de dix (pratique actuelle) à quatre ou même trois administrations, à condition de retarder le début du traitement prophylactique par le rhG-CSF. Dans un souci d'applicabilité clinique de notre approche de modélisation, nous avons investigué l'impact de la variabilité PK présente dans une population de patients, sur les prédictions du modèle, en intégrant des modèles PK de population (Pop-PK) des deux médicaments. En considérant des cohortes de 500 patients in silico pour chacun des cinq scénarios de variabilité plausibles et en utilisant trois marqueurs cliniques, soient le temps au nadir des neutrophiles, la valeur du nadir, ainsi que l'aire sous la courbe concentration-effet, nous avons établi qu'il n'y avait aucune différence significative dans les prédictions du modèle entre le patient-type et la population. Ceci démontre la robustesse de l'approche que nous avons développée et qui s'apparente à une approche de pharmacologie quantitative des systèmes (QSP). Motivés par l'utilisation du rhG-CSF dans le traitement d'autres maladies, comme des pathologies périodiques telles que la neutropénie cyclique, nous avons ensuite soumis l'étude du modèle au contexte des maladies dynamiques. En mettant en évidence la non validité du paradigme de la rétroaction des cytokines pour l'administration exogène des mimétiques du G-CSF, nous avons développé un modèle physiologique PK/PD novateur comprenant les concentrations libres et liées du G-CSF. Ce nouveau modèle PK a aussi nécessité des changements dans le modèle PD puisqu’il nous a permis de retracer les concentrations du G-CSF lié aux neutrophiles. Nous avons démontré que l'hypothèse sous-jacente de l'équilibre entre la concentration libre et liée, selon la loi d'action de masse, n'est plus valide pour le G-CSF aux concentrations endogènes et mènerait en fait à la surestimation de la clairance rénale du médicament. En procédant ainsi, nous avons réussi à reproduire des données cliniques obtenues dans diverses conditions (l'administration exogène du G-CSF, l'administration du PM00104, CHOP14). Nous avons aussi fourni une explication logique des mécanismes responsables de la réponse physiologique aux deux médicaments. Finalement, afin de mettre en exergue l’approche intégrative en pharmacologie adoptée dans cette thèse, nous avons démontré sa valeur inestimable pour la mise en lumière et la reconstruction des systèmes vivants complexes, en faisant le parallèle avec d’autres disciplines scientifiques telles que la paléontologie et la forensique, où une approche semblable a largement fait ses preuves. Nous avons aussi discuté du potentiel de la pharmacologie quantitative des systèmes appliquées au développement du médicament et à la médecine translationnelle, en se servant du modèle physio-PK/PD que nous avons mis au point.

Establishing a Robust In Vitro Embryonic Stem Cell Differentiation Assay to Monitor the Hematopoietic Potential of DELES Clones

Afin d’effectuer des études fonctionnelles sur le génome de la souris, notre laboratoire a généré une bibliothèque de clones de cellules souches embryonnaires (ESC) présentant des suppressions chromosomiques chevauchantes aléatoires – la bibliothèque DELES. Cette bibliothèque contient des délétions couvrant environ 25% du génome murin. Dans le laboratoire, nous comptons identifier de nouveaux déterminants du destin des cellules hématopoïétiques en utilisant cet outil. Un crible primaire utilisant la benzidine pour démontrer la présence d'hémoglobine dans des corps embryoïdes (EBS) a permis d’identifier plusieurs clones délétés présentant un phénotype hématopoïétique anormal. Comme cet essai ne vérifie que la présence d'hémoglobine, le but de mon projet est d'établir un essai in vitro de différenciation des ESC permettant de mesurer le potentiel hématopoïétique de clones DELES. Mon hypothèse est que l’essai de différenciation hématopoïétique publié par le Dr Keller peut être importé dans notre laboratoire et utilisé pour étudier l'engagement hématopoïétique des clones DELES. À l’aide d’essais de RT-QPCR et de FACS, j’ai pu contrôler la cinétique de différenciation hématopoïétique en suivant l’expression des gènes hématopoïétiques et des marqueurs de surface comme CD41, c-kit, RUNX1, GATA2, CD45, β-globine 1 et TER-119. Cet essai sera utilisé pour valider le potentiel hématopoïétique des clones DELES candidats identifiés dans le crible principal. Mon projet secondaire vise à utiliser la même stratégie rétro-virale a base de Cre-loxP utilisée pour générer la bibliothèque DELES pour générer une bibliothèque de cellules KBM-7 contenant des suppressions chromosomiques chevauchantes. Mon but ici est de tester si la lignée cellulaire leuémique humaine presque haploïde KBM-7 peut être exploitée en utilisant l'approche DELES pour créer cette bibliothèque. La bibliothèque de clones KBM-7 servira à définir les activités moléculaires de drogues anti-leucémiques potentielless que nous avons identifiées dans le laboratoire parce qu’elles inhibent la croissance cellulaire dans plusieurs échantillons de leucémie myéloïde aiguë dérivés de patients. Elle me permettra également d'identifier les voies de signalisation moléculaires qui, lorsque génétiquement perturbées, peuvent conférer une résistance à ces drogues.