Additions stéréosélectives sur des imines : du développement d'un auxiliaire à la catalyse asymétrique

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude fonctionnelle des domaines structuraux des sous-unités catalytiques de l'ARN polymérase II humaine

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Amélioration des propriétés pharmacocinétiques de peptides par différentes alkylations N-terminales

Modélisations moléculaires réalisés avec le logiciel HyperChem 8.

Design and synthesis of constrained azacyclic pyrrolidine analogues of FTY720 as anticancer agents & metal coordination-controlled and bifunctional catalysis toward tertiary β-Ketols

Cette thèse se compose en deux parties: Première Partie: La conception et la synthèse d’analogues pyrrolidiniques, utilisés comme agents anticancéreux, dérivés du FTY720. FTY720 est actuellement commercialisé comme médicament (GilenyaTM) pour le traitement de la sclérose en plaques rémittente-récurrente. Il agit comme immunosuppresseur en raison de son effet sur les récepteurs de la sphingosine-1-phosphate. A fortes doses, FTY720 présente un effet antinéoplasique. Cependant, à de telles doses, un des effets secondaires observé est la bradycardie dû à l’activation des récepteurs S1P1 et S1P3. Ceci limite son potentiel d’utilisation lors de chimiothérapie. Nos précédentes études ont montré que des analogues pyrrolidiniques dérivés du FTY720 présentaient une activité anticancéreuse mais aucune sur les récepteurs S1P1 et S1P3. Nous avons soumis l’idée qu’une étude relation structure-activité (SARs) pourrait nous conduire à la découverte de nouveaux agents anti tumoraux. Ainsi, deux séries de composés pyrrolidiniques (O-arylmethyl substitué et C-arylmethyl substitué) ont pu être envisagés et synthétisés (Chapitre 1). Ces analogues ont montré d’excellentes activités cytotoxiques contre diverses cellules cancéreuses humaines (prostate, colon, sein, pancréas et leucémie), plus particulièrement les analogues actifs qui ne peuvent pas être phosphorylés par SphK, présentent un plus grand potentiel pour le traitement du cancer sans effet secondaire comme la bradycardie. Les études mécanistiques suggèrent que ces analogues de déclencheurs de régulation négative sur les transporteurs de nutriments induisent une crise bioénergétique en affamant les cellules cancéreuses. Afin d’approfondir nos connaissances sur les récepteurs cibles, nous avons conçu et synthétisé des sondes diazirine basées sur le marquage d’affinité aux photons (méthode PAL: Photo-Affinity Labeling) (Chapitre 2). En s’appuyant sur la méthode PAL, il est possible de récolter des informations sur les récepteurs cibles à travers l’analyse LC/MS/MS de la protéine. Ces tests sont en cours et les résultats sont prometteurs. Deuxième partie: Coordination métallique et catalyse di fonctionnelle de dérivés β-hydroxy cétones tertiaires. Les réactions de Barbier et de Grignard sont des méthodes classiques pour former des liaisons carbone-carbone, et généralement utilisées pour la préparation d’alcools secondaires et tertiaires. En vue d’améliorer la réaction de Grignard avec le 1-iodobutane dans les conditions « one-pot » de Barbier, nous avons obtenu comme produit majoritaire la β-hydroxy cétone provenant de l’auto aldolisation de la 5-hexen-2-one, plutôt que le produit attendu d’addition de l’alcool (Chapitre 3). La formation inattendue de la β-hydroxy cétone a également été observée en utilisant d’autres dérivés méthyl cétone. Étonnement dans la réaction intramoléculaire d’une tricétone, connue pour former la cétone Hajos-Parrish, le produit majoritaire est rarement la β-hydroxy cétone présentant la fonction alcool en position axiale. Intrigué par ces résultats et après l’étude systématique des conditions de réaction, nous avons développé deux nouvelles méthodes à travers la synthèse sélective et catalytique de β-hydroxy cétones spécifiques par cyclisation intramoléculaire avec des rendements élevés (Chapitre 4). La réaction peut être catalysée soit par une base adaptée et du bromure de lithium comme additif en passant par un état de transition coordonné au lithium, ou bien soit à l’aide d’un catalyseur TBD di fonctionnel, via un état de transition médiée par une coordination bidenté au TBD. Les mécanismes proposés ont été corroborés par calcul DFT. Ces réactions catalytiques ont également été appliquées à d’autres substrats comme les tricétones et les dicétones. Bien que les efforts préliminaires afin d’obtenir une enantioselectivité se sont révélés sans succès, la synthèse et la recherche de nouveaux catalyseurs chiraux sont en cours.

Études d'ingénierie du ribozyme VS de Neurospora

Les ribozymes sont des ARN catalytiques fréquemment exploités pour le développement d’outils biochimiques et d’agents thérapeutiques. Ils sont particulièrement intéressants pour effectuer l’inactivation de gènes, en permettant la dégradation d’ARNm ou d’ARN viraux associés à des maladies. Les ribozymes les plus utilisés en ce moment pour le développement d’agents thérapeutiques sont les ribozymes hammerhead et hairpin, qui permettent la reconnaissance spécifique d’ARN simple brin par la formation de structures secondaires stables. In vivo, la majorité des ARN adoptent des structures secondaires et tertiaires complexes et les régions simples brins sont parfois difficiles d’accès. Il serait intéressant de pouvoir cibler des ARN repliés et un motif d’ARN intéressant à cibler est la tige-boucle d’ARN qui peut être importante dans le repliement global des ARN et pour accomplir des fonctions biologiques. Le ribozyme VS de Neurospora fait la reconnaissance de son substrat replié en tigeboucle de façon spécifique par une interaction kissing-loop, mais il n’a jamais été exploité pour faire la reconnaissance d’un ARN cible très différent de son substrat naturel. Le but des travaux présentés dans cette thèse est de déterminer si le ribozyme VS possède l’adaptabilité nécessaire pour l’ingénierie de ribozymes qui clivent des ARN cibles différents du substrat naturel. Dans le cadre de cette thèse, le ribozyme VS a été modifié pour l’adapter à différents substrats et des études de cinétiques ont été réalisées pour évaluer l’impact de ces modifications sur l’activité de clivage du ribozyme. Dans un premier temps, le ribozyme a été modifié pour faire la reconnaissance et le clivage de substrats possédant différentes longueurs de tiges Ib. Le ribozyme a été adapté avec succès à ces substrats de différentes longueurs de tige Ib, avec une activité qui est similaire à celle du ribozyme avec un substrat sans modification. Dans un deuxième temps, c’est l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme qui a été substituée de façon rationnelle, dans le but de savoir si un ribozyme VS mutant peut reconnaitre et cliver un substrat ayant une boucle différente de celle de son substrat naturel. L’interaction kissing-loop I/V a été substituée pour les interactions kissing-loop TAR/TAR* de l’ARN du VIH-1 et L22/L88 de l’ARN 23S de Deinococcus radiodurans. La réaction de iii clivage des ribozymes comportant ces nouvelles interactions kissing-loop est toujours observée, mais avec une activité diminuée. Finalement, la sélection in vitro (SELEX) de ribozymes a été effectuée pour permettre un clivage plus efficace d’un substrat mutant avec une nouvelle boucle. Le SELEX a permis la sélection d’un ribozyme qui clive un substrat avec une boucle terminale mutée pour celle de l’ARN TAR du VIH-1 et cela avec une activité de clivage très efficace. L’ensemble de ces études démontre que le ribozyme VS peut être modifié de diverses façons pour la reconnaissance spécifique de différents substrats, tout en conservant une bonne activité de clivage. Ces résultats montrent le grand potentiel d’ingénierie du ribozyme VS et sont prometteurs pour la poursuite d’études d’ingénierie du ribozyme VS, en vue du clivage d’ARN cibles repliés en tige-boucle complètement différents du substrat naturel du ribozyme VS.

Phosphodiesterase 6 generates intracellular cGMP microdomains in the native endothelium

Endothelial cells (EC) are essential regulator of vascular homeostasis through the generation and release of various bioactive agents, including nitric oxide (NO). NO modulates several vascular functions such as vascular tone and permeability, through the stimulation of soluble guanylate cyclase (sGC) leading to the production of cGMP. Conversely, phosphodiesterases (PDEs) are enzymes metabolizing cyclic nucleotides (cGMP and cAMP) and are therefore major regulatory players for cGMP and cAMP signalling pathways. Although ECs are the main source of NO, little is known on the endothelial NO-cGMP signalling pathway and cellular outcomes. It was then hypothesized that a specific population of cGMP-phosphodiesterases allows ECs to stabilize cGMP levels despite the elevated production of NO. Expression of cGMP-phosphodiesterases was initially studied in resistance mesenteric arteries from mice. PDE5 and PDE6 were both found at mRNA and protein levels in native arteries but PDE6 is not found in cultured ECs. Interestingly, subcellular distributions of both enzymes were distinct. PDE5 appeared to be homogeneously distributed whilst PDE6 catalytic subunits (PDE6 and PDE6) showed a preferential staining in the perinuclear region. These results suggest that PDE6 might be involved in the regulation of cGMP microdomains. Based on these findings, a mathematical model was developed. Simulations of dynamic cGMP levels in ECs support the notion of cGMP microdomains dependent on PDE6 expression and localization. In the absence of PDE6, application of NO either as a single bolus or repetitive pulses led to a homogeneous increase in cGMP levels in ECs despite PDE5 homogeneous distribution. However, PDE6 subcellular targeting to the perinuclear membrane generated a cGMP-depleted perinuclear space. The findings from this study provide the first evidence of the expression and specific intracellular distribution of PDE6 in native endothelial cells that strongly support their involvement in the generation of cGMP microdomains